| 中文摘要 | 第4-5页 |
| ABSTRACT | 第5-6页 |
| 缩略词表 | 第7-12页 |
| 第一章 绪论 | 第12-19页 |
| 1 副溶血弧菌 | 第12页 |
| 2 副溶血弧菌Ⅲ型分泌系统 | 第12-13页 |
| 3 Ⅲ型分泌系统相关效应蛋白的研究现状 | 第13-17页 |
| 3.1 T3SS1效应蛋白的研究现状 | 第13-14页 |
| 3.2 T3SS2效应蛋白的研究现状 | 第14-17页 |
| 4 环二鸟苷酸（c-di-GMP） | 第17-18页 |
| 5 研究目的和意义 | 第18-19页 |
| 第二章 VPA1324和VPA1360基因表达载体的构建、蛋白纯化及其抗血清的制备 | 第19-35页 |
| 1 前言 | 第19页 |
| 2 实验材料、仪器和试剂 | 第19-22页 |
| 2.1 主要材料 | 第19页 |
| 2.2 主要仪器 | 第19-20页 |
| 2.3 主要试剂 | 第20-21页 |
| 2.4 主要溶液配制 | 第21-22页 |
| 3 实验方法 | 第22-29页 |
| 3.1 VPA1324和VPA1360基因的引物设计 | 第22页 |
| 3.2 副溶血弧菌基因组DNA的提取 | 第22-23页 |
| 3.3 VPA1324和VPA1360基因的扩增 | 第23页 |
| 3.4 pET-28a(+)质粒的提取 | 第23-24页 |
| 3.5 VPA1324和VPA1360基因的双酶切 | 第24页 |
| 3.6 pET-28a(+)质粒的双酶切 | 第24-25页 |
| 3.7 VPA1324和VPA1360基因和pET-28a(+)质粒酶切片段连接 | 第25页 |
| 3.8 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备 | 第25-26页 |
| 3.9 连接产物转化DH5α感受态细胞 | 第26页 |
| 3.10 重组质粒pET28a(+)-VPA1324和pET28a(+)-VPA1360的鉴定 | 第26-27页 |
| 3.10.1 重组质粒pET28a(+)-VPA1324和pET28a(+)-VPA1360的双酶切鉴定 | 第26-27页 |
| 3.10.2 重组质粒pET28a(+)-VPA1324和pET28a(+)-VPA1360的测序鉴定 | 第27页 |
| 3.11 VPA1324和VPA1360的诱导表达 | 第27页 |
| 3.12 VPA1324和VPA1360的纯化 | 第27-28页 |
| 3.13 VPA1324和VPA1360抗血清的制备 | 第28-29页 |
| 3.13.1 VPA1324和VPA1360免疫小鼠 | 第28页 |
| 3.13.2 抗血清效价的检测 | 第28页 |
| 3.13.3 抗血清的获取 | 第28-29页 |
| 4 实验结果 | 第29-33页 |
| 4.1 PCR扩增VPA1324和VPA1360基因 | 第29页 |
| 4.2 重组质粒pET28a(+)-VPA1324和pET28a(+)-VPA1360的鉴定 | 第29-30页 |
| 4.2.1 重组质粒pET28a(+)-VPA1324和pET28a(+)-VPA1360的双酶切鉴定 | 第29-30页 |
| 4.2.2 重组质粒pET28a(+)-VPA1324和pET28a(+)-VPA1360的测序鉴定 | 第30页 |
| 4.3 VPA1324和VPA1360的诱导表达 | 第30-33页 |
| 4.4 VPA1324和VPA1360免疫小鼠后抗血清效价的检测 | 第33页 |
| 5 讨论 | 第33-35页 |
| 第三章 验证VPA1324和VPA1360是可分泌的效应蛋白 | 第35-42页 |
| 1 前言 | 第35页 |
| 2 实验材料、仪器和试剂 | 第35页 |
| 2.1 主要试剂 | 第35页 |
| 2.2 主要溶液配制 | 第35页 |
| 3 实验方法 | 第35-39页 |
| 3.1 RT-PCR检测POR1菌在正常和胆盐作用下VPA1324和VPA1360转录情况 | 第35-38页 |
| 3.1.1 RT-PCR引物的设计 | 第35-36页 |
| 3.1.2 细菌总RNA的提取 | 第36-37页 |
| 3.1.3 总RNA的反转录 | 第37页 |
| 3.1.4 RT-PCR检测VPA1324和VPA1360表达情况 | 第37-38页 |
| 3.2 Western blot检验VPA1324和VPA1360蛋白的分泌状况 | 第38-39页 |
| 3.2.1 菌体和分泌蛋白的提取 | 第38-39页 |
| 3.2.2 Western blot检验VPA1324和VPA1360蛋白的分泌情况 | 第39页 |
| 4 实验结果 | 第39-41页 |
| 4.1 RT-PCR验证VPA1324和VPA1360基因的转录表达情况 | 第39-40页 |
| 4.2 Western blot分析VPA1324、VPA1360的分泌情况 | 第40-41页 |
| 5 讨论 | 第41-42页 |
| 第四章 VPA1324磷酸二酯酶活性及细胞毒力检测 | 第42-57页 |
| 1 前言 | 第42-43页 |
| 2 实验材料、仪器和试剂 | 第43页 |
| 2.1 主要材料 | 第43页 |
| 2.2 主要仪器 | 第43页 |
| 2.3 主要试剂 | 第43页 |
| 2.4 主要溶液配制 | 第43页 |
| 3 实验方法 | 第43-48页 |
| 3.1 HPLC检测VPA1324蛋白酶活性 | 第43-44页 |
| 3.2 VPA1324基因荧光表达载体的构建 | 第44-46页 |
| 3.2.1 VPA1324基因的引物设计 | 第44页 |
| 3.2.2 VPA1324基因的扩增 | 第44-45页 |
| 3.2.3 VPA1324基因和p EGFP-C1质粒酶切片段连接 | 第45-46页 |
| 3.3 重组质粒p EGFP-VPA1324-C1的鉴定 | 第46页 |
| 3.3.1 重组质粒p EGFP-VPA1324-C1的双酶切鉴定 | 第46页 |
| 3.3.2 重组质粒p EGFP-VPA1324-C1的测序鉴定 | 第46页 |
| 3.4 重组质粒p EGFP-VPA1324-C1转染Hela和Caco-2 细胞 | 第46-48页 |
| 3.4.1 细胞复苏 | 第46-47页 |
| 3.4.2 细胞传代 | 第47页 |
| 3.4.3 细胞计数 | 第47页 |
| 3.4.4 重组质粒p EGFP-VPA1324-C1转染细胞 | 第47-48页 |
| 3.4.5 Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡 | 第48页 |
| 3.4.6 Hoechst 33342 荧光染色 | 第48页 |
| 4 实验结果 | 第48-55页 |
| 4.1 HPLC检测VPA1324磷酸二酯酶活性 | 第48-49页 |
| 4.2 PCR扩增VPA1324基因 | 第49-50页 |
| 4.3 重组质粒p EGFP-VPA1324-C1的鉴定 | 第50-55页 |
| 4.3.1 重组质粒p EGFP-VPA1324-C1的双酶切鉴定 | 第50页 |
| 4.3.2 重组质粒p EGFP-VPA1324-C1的测序鉴定 | 第50-51页 |
| 4.3.3 细胞转染重组质粒后的荧光表达情况 | 第51-52页 |
| 4.3.4 Annexin V-FITC/PI 双染法检测细胞凋亡 | 第52-53页 |
| 4.3.5 Hoechst 33342 荧光染色实验 | 第53-55页 |
| 5 讨论 | 第55-57页 |
| 第五章 结论与展望 | 第57-58页 |
| 1 结论 | 第57页 |
| 2 展望 | 第57-58页 |
| 参考文献 | 第58-64页 |
| 攻读学位期间的研究成果 | 第64-65页 |
| 致谢 | 第65页 |
