| 摘要 | 第8-10页 |
| ABSTRACT | 第10-12页 |
| 前言 | 第13-15页 |
| 第一部分 CRKⅡ下调抑制Hca-P体外增殖、迁移、侵袭及淋巴结黏附能力 | 第15-27页 |
| 材料和方法 | 第15-21页 |
| （一）材料 | 第15-16页 |
| 1.实验动物和细胞系 | 第15页 |
| 2.主要仪器和设备 | 第15-16页 |
| 3.Hca-P细胞株传代及保种 | 第16页 |
| （二）方法 | 第16-21页 |
| 1.siRNA序列设计 | 第16-17页 |
| 2.表达载体的构建 | 第17页 |
| 3.CRKⅡ表达稳定下调的Hca-P细胞株的建立 | 第17-18页 |
| 4.Western Blot检测各组单克隆细胞株CRKⅡ蛋白表达水平 | 第18-19页 |
| 5.台盼蓝计数法检测CRKⅡ下调对Hca-P细胞增殖能力影响 | 第19页 |
| 6.软琼脂克隆形成实验检测CRKⅡ下调对Hca-P克隆形成能力影响 | 第19-20页 |
| 7.Transwell小室法检测CRKⅡ下调对Hca-P体外迁移能力影响 | 第20页 |
| 8.Transwell小室法检测CRKⅡ下调对Hca-P体外侵袭能力影响 | 第20页 |
| 9.CRKⅡ下调对Hca-P细胞黏附能力影响 | 第20页 |
| 10.统计学分析 | 第20-21页 |
| 结果 | 第21-25页 |
| 1.转染效率 | 第21页 |
| 2.Western Blot检测单克隆细胞株CRKⅡ蛋白表达水平 | 第21页 |
| 3.CRKⅡ下调抑制Hca-P细胞体外增殖能力 | 第21-22页 |
| 4.CRKⅡ下调抑制Hca-P细胞克隆形成能力 | 第22页 |
| 5.CRKⅡ下调抑制Hca-P细胞迁移能力 | 第22-23页 |
| 6.CRKⅡ下调抑制Hca-P细胞侵袭能力 | 第23-24页 |
| 7.CRKⅡ下调抑制Hca-P细胞淋巴结黏附形能力 | 第24-25页 |
| 讨论 | 第25-26页 |
| 结论 | 第26-27页 |
| 第二部分 CRKⅡ表达上调促进Hca-P体外增殖、克隆形成、迁移及侵袭能力 | 第27-43页 |
| 材料和方法 | 第27-36页 |
| （一）材料 | 第27-29页 |
| 1.细胞系和菌种 | 第27页 |
| 2.引物和菌种 | 第27页 |
| 3.主要仪器和设备 | 第27-29页 |
| 4.主要溶剂配制 | 第29页 |
| （二）方法 | 第29-36页 |
| 1.细胞培养和菌种复苏 | 第29-30页 |
| 2.目的基因CRKⅡ的扩增 | 第30-31页 |
| 3.PCR产物回收纯化（TIANGEN DNA纯化回收试剂盒） | 第31-32页 |
| 4.pEASY-CRKⅡ克隆质粒的构建及鉴定 | 第32-34页 |
| 5.pcDNA3.1/V5-HisB-CRKⅡ真核表达质粒的构建 | 第34-35页 |
| 6.真核表达载体转染Hca-P细胞 | 第35页 |
| 7.Western Blot检测各组细胞CRKⅡ蛋白表达水平 | 第35页 |
| 8.CCK-8 法检测CRKⅡ上调对Hca-P增殖能力影响 | 第35页 |
| 9.克隆形成法检测CRKⅡ上调对Hca-P克隆形成能力影响 | 第35页 |
| 10.Transwell法检测CRKⅡ上调对Hca-P迁移和侵袭能力影响 | 第35-36页 |
| 结果 | 第36-41页 |
| 1.目的基因CRKⅡCDs PCR产物鉴定 | 第36页 |
| 2.pEASY-blunt simple-CRKⅡ重组克隆质粒鉴定 | 第36-37页 |
| 3.pcDNA3.1/V5-HisB-CRKⅡ真核表达质粒鉴定 | 第37-38页 |
| 4.瞬时上调CRKⅡ的表达 | 第38页 |
| 5.CRKⅡ表达上调促进Hca-P细胞体外增殖能力 | 第38-39页 |
| 6.CRKⅡ表达上调促进Hca-P细胞体外克隆形成能力 | 第39页 |
| 7.CRKⅡ表达上调促进Hca-P细胞体外迁移能力 | 第39-40页 |
| 8.CRKⅡ表达上调促进Hca-P细胞体外侵袭能力 | 第40-41页 |
| 讨论 | 第41-42页 |
| 结论 | 第42-43页 |
| 第三部分 CRKⅡ水平变化对p130cas/CRK/Dock180/Rac1信号通路影响 | 第43-47页 |
| 材料和方法 | 第43-45页 |
| （一）材料 | 第43-44页 |
| 1.细胞系 | 第43页 |
| 2.真核表达载体 | 第43页 |
| 3.主要仪器试剂 | 第43-44页 |
| （二）方法 | 第44-45页 |
| 1.转染 | 第44页 |
| 2.CRKⅡ变化对Hca-P中p130cas、Dock180、Rac1蛋白表达影响 | 第44-45页 |
| 结果 | 第45-46页 |
| 1.CRKⅡ下调对p130CAS、DOCK180、Rac1的影响 | 第45页 |
| 2.CRKⅡ上调对p130CAS、DOCK180的影响 | 第45-46页 |
| 讨论 | 第46页 |
| 结论 | 第46-47页 |
| 参考文献 | 第47-50页 |
| 综述 接头蛋白CRK(CRKⅠ/Ⅱ)与人类恶性肿瘤 | 第50-58页 |
| 参考文献 | 第55-58页 |
| 致谢 | 第58-59页 |
