| 摘要 | 第4-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 1 绪论 | 第10-17页 |
| 1.1 逆境胁迫对植物的影响 | 第10页 |
| 1.2 植物半胱氨酸蛋白酶抑制剂的研究概况 | 第10-11页 |
| 1.3 酵母双杂交技术的研究进展及应用 | 第11-14页 |
| 1.3.1 酵母双杂交技术的原理 | 第11-12页 |
| 1.3.2 酵母双杂交技术的发展 | 第12-14页 |
| 1.3.3 酵母双杂交系统的应用 | 第14页 |
| 1.4 钙离子依赖性核酸酶的研究概况 | 第14-15页 |
| 1.4.1 核酸酶简介 | 第14-15页 |
| 1.4.2 钙离子依赖性核酸酶的研究进展 | 第15页 |
| 1.5 本研究的目的和意义 | 第15-17页 |
| 2 “诱饵”表达载体的构建及自激活和毒性检测 | 第17-25页 |
| 2.1 实验材料 | 第17-19页 |
| 2.1.1 菌株和载体 | 第17-18页 |
| 2.1.2 培养基及其配方 | 第18-19页 |
| 2.2 实验方法 | 第19-22页 |
| 2.2.1 AtCYSb目的片段的PCR扩增 | 第19页 |
| 2.2.2 PCR产物的回收 | 第19页 |
| 2.2.3 连接pMD18-T载体 | 第19页 |
| 2.2.4 大肠杆菌感受态的制备 | 第19-20页 |
| 2.2.5 大肠杆菌转化 | 第20页 |
| 2.2.6 煮沸法提取质粒DNA并酶切鉴定 | 第20-21页 |
| 2.2.7 试剂盒提取质粒DNA | 第21页 |
| 2.2.8 酵母感受态细胞的制备及酵母转化 | 第21-22页 |
| 2.2.9 自激活检测和毒性检测 | 第22页 |
| 2.3 结果与分析 | 第22-24页 |
| 2.3.1 目的条带的PCR扩增及“诱饵”表达载体的酶切鉴定 | 第22-23页 |
| 2.3.2 “诱饵”表达载体的自激活检测和毒性检测 | 第23-24页 |
| 2.4 本章小结 | 第24-25页 |
| 3 文库的筛选,全长cDNA的克隆及酵母双杂交检测 | 第25-36页 |
| 3.1 实验材料 | 第25-27页 |
| 3.1.1 菌株 | 第25页 |
| 3.1.2 载体 | 第25-26页 |
| 3.1.3 培养基及其配方 | 第26-27页 |
| 3.2 实验方法 | 第27-30页 |
| 3.2.1 文库融合筛选 | 第27-28页 |
| 3.2.2 转化效率的计算方法 | 第28页 |
| 3.2.3 酵母总DNA的提取 | 第28-29页 |
| 3.2.4 PCR检测和酶切检测 | 第29页 |
| 3.2.5 测序及比对分析 | 第29页 |
| 3.2.6 共转化验证 | 第29-30页 |
| 3.3 结果与分析 | 第30-35页 |
| 3.3.1 拟南芥cDNA文库初步筛选结果 | 第30页 |
| 3.3.2 融合率的计算 | 第30-31页 |
| 3.3.3 PCR检测提取的酵母总DNA | 第31页 |
| 3.3.4 酵母总DNA转化大肠杆菌JM109后PCR和酶切鉴定 | 第31-32页 |
| 3.3.5 测序结果及分析 | 第32-33页 |
| 3.3.6 共转化验证 | 第33-35页 |
| 3.4 本章小结 | 第35-36页 |
| 4 相互作用验证 | 第36-50页 |
| 4.1 实验材料 | 第36-37页 |
| 4.1.1 菌株及载体 | 第36页 |
| 4.1.2 药品与试剂 | 第36-37页 |
| 4.2 实验方法 | 第37-42页 |
| 4.2.1 pGEX-6p-3-AtCYSb融合表达载体的构建 | 第37页 |
| 4.2.2 GST-AtCYSb融合蛋白的小量诱导表达 | 第37-38页 |
| 4.2.3 GST-AtCYSb融合蛋白的大量诱导及纯化 | 第38页 |
| 4.2.4 pQE-30-AtCaN2重组质粒的构建 | 第38-39页 |
| 4.2.5 pQE-30-AtCaN2表达载体转化大肠杆菌M15 | 第39页 |
| 4.2.6 His-AtCaN2融合蛋白的小量诱导 | 第39-40页 |
| 4.2.7 His-AtCaN2融合蛋白的大量表达及纯化 | 第40页 |
| 4.2.8 Pull-Down验证AtCYSb与AtCaN2蛋白之间的相互作用 | 第40-41页 |
| 4.2.9 琼脂糖凝胶电泳检测AtCYSb与AtCaN2蛋白之间的相互作用 | 第41-42页 |
| 4.3 结果与分析 | 第42-49页 |
| 4.3.1 GST-AtCYSb融合表达载体的酶切鉴定 | 第42-43页 |
| 4.3.2 GST-AtCYSb融合蛋白的表达 | 第43-44页 |
| 4.3.3 GST-AtCYSb融合蛋白的纯化 | 第44页 |
| 4.3.4 His-AtCaN2融合表达载体的酶切鉴定 | 第44-45页 |
| 4.3.5 His-AtCaN2融合蛋白的表达 | 第45-46页 |
| 4.3.6 His-AtCaN2融合蛋白的大量诱导及纯化 | 第46页 |
| 4.3.7 Pull-Down验证AtCYSb与AtCaN2蛋白之间的相互作用 | 第46-47页 |
| 4.3.8 琼脂糖凝胶电泳检测AtCYSb与AtCaN2蛋白之间的相互作用 | 第47-49页 |
| 4.4 本章小结 | 第49-50页 |
| 5 核酸酶AtCaN2活性分析 | 第50-54页 |
| 5.1 实验材料 | 第50页 |
| 5.2 实验方法 | 第50-51页 |
| 5.2.1 温度对核酸酶AtCaN2活性的影响 | 第50页 |
| 5.2.2 金属离子对核酸酶AtCaN2活性的影响 | 第50-51页 |
| 5.2.3 pH条件对核酸酶AtCaN2活性的影响 | 第51页 |
| 5.3 实验结果 | 第51-53页 |
| 5.3.1 温度对核酸酶AtCaN2活性的影响 | 第51-52页 |
| 5.3.2 金属离子对核酸酶AtCaN2活性的影响 | 第52页 |
| 5.3.3 pH条件对核酸酶AtCaN2活性的影响 | 第52-53页 |
| 5.4 本章小结 | 第53-54页 |
| 结论与展望 | 第54-56页 |
| 参考文献 | 第56-63页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 | 第63-64页 |
| 致谢 | 第64-65页 |
