| 摘要 | 第3-5页 |
| ABSTRACT | 第5-6页 |
| 第一章 研究背景及意义 | 第11-30页 |
| 1.1 研究背景 | 第11-28页 |
| 1.1.1 Dicer 蛋白 | 第12-13页 |
| 1.1.2 AGO 蛋白 | 第13-14页 |
| 1.1.3 植物中的sRNA | 第14-17页 |
| 1.1.3.1 植物中的 miRNA 和 ta-siRNA | 第14-15页 |
| 1.1.3.2 Nat-siRNA | 第15-16页 |
| 1.1.3.3 Hc-siRNA | 第16-17页 |
| 1.1.4 植物miRNA的产生 | 第17-25页 |
| 1.1.4.1 植物 MIR 基因的转录 | 第17-18页 |
| 1.1.4.2 植物Pri-miRNA的加工 | 第18-19页 |
| 1.1.4.3 Pri-miRNA的加工与剪接之间的联系 | 第19-20页 |
| 1.1.4.4 Pri-miRNA的加工与转录之间的联系 | 第20页 |
| 1.1.4.5 miRNA的转运及代谢 | 第20-21页 |
| 1.1.4.6 RISC复合物的组装及功能 | 第21-24页 |
| 1.1.4.7 miRNA通路的自我调节 | 第24页 |
| 1.1.4.8 miRNA的功能 | 第24-25页 |
| 1.1.5 Pol Ⅱ转录过程 | 第25-26页 |
| 1.1.6 XAP5 蛋白 | 第26页 |
| 1.1.7 Elongator复合物 | 第26-28页 |
| 1.1.7.1 Elongator复合物的发现及组成 | 第26页 |
| 1.1.7.2 Elongator复合物在转录过程中的作用 | 第26-28页 |
| 1.1.7.3 植物中的Elongator复合物 | 第28页 |
| 1.2 本研究的意义 | 第28-30页 |
| 第二章 实验材料与实验方法 | 第30-56页 |
| 2.1 实验材料 | 第30-32页 |
| 2.1.1 植物材料 | 第30页 |
| 2.1.2 酶与生物化学试剂 | 第30-32页 |
| 2.1.2.1 植物培养 | 第30页 |
| 2.1.2.2 载体构建 | 第30-31页 |
| 2.1.2.3 基因组DNA提取 | 第31页 |
| 2.1.2.4 全基因组重测序 | 第31页 |
| 2.1.2.5 RNA 提取、反转录与荧光定量 PCR | 第31页 |
| 2.1.2.6 sRNA northern分析和克隆 | 第31页 |
| 2.1.2.7 DNA甲基化分析 | 第31页 |
| 2.1.2.8 免疫沉淀和western检测 | 第31-32页 |
| 2.1.2.9 其他化学试剂 | 第32页 |
| 2.2 实验方法 | 第32-56页 |
| 2.2.1 植物培养 | 第32-33页 |
| 2.2.1.1 培养土中拟南芥的培养 | 第32页 |
| 2.2.1.2 1/2MS培养基中拟南芥的培养 | 第32-33页 |
| 2.2.2 突变体的筛选 | 第33页 |
| 2.2.2.1 amiR-triOX转基因系的构建 | 第33页 |
| 2.2.2.2 EMS诱变及筛选 | 第33页 |
| 2.2.3 基因组DNA的提取 | 第33-34页 |
| 2.2.4 基于全基因组重测序的方法克隆突变体基因 | 第34-36页 |
| 2.2.4.1 克隆群体的建立 | 第34页 |
| 2.2.4.2 全基因组重测序文库的建立 | 第34-35页 |
| 2.2.4.3 测序数据的分析及验证 | 第35-36页 |
| 2.2.5 Real time PCR检测miRNA靶基因的表达 | 第36-38页 |
| 2.2.5.1 植物总RNA的提取 | 第36页 |
| 2.2.5.2 DNA酶消化总RNA中的DNA | 第36-37页 |
| 2.2.5.3 RNA反转录合成cDNA的第一链 | 第37页 |
| 2.2.5.4 Real time PCR | 第37-38页 |
| 2.2.6 Real time PCR检测miRNA的积累 | 第38-39页 |
| 2.2.6.1 总RNA的提取及去除其中的DNA(同上) | 第38页 |
| 2.2.6.2 miRNA的反转录(参照Takara PrimeScript miRNA RT-PCR Kit) | 第38页 |
| 2.2.6.3 Realtime PCR反应 | 第38-39页 |
| 2.2.7 Northern blot检测miRNA的表达 | 第39-41页 |
| 2.2.7.1 植物小 RNA的提取 | 第39页 |
| 2.2.7.2 小 RNA的垂直板电泳 | 第39-40页 |
| 2.2.7.3 转膜 | 第40页 |
| 2.2.7.4 探针标记和杂交 | 第40-41页 |
| 2.2.7.5 洗膜和显影 | 第41页 |
| 2.2.8 载体构建 | 第41-44页 |
| 2.2.8.1 PCR扩增目标片段 | 第41-42页 |
| 2.2.8.2 PCR产物的琼脂糖凝胶纯化 | 第42页 |
| 2.2.8.3 酶切 | 第42页 |
| 2.2.8.4 连接 | 第42-43页 |
| 2.2.8.5 大肠杆菌热激转化 | 第43页 |
| 2.2.8.6 碱裂解法小量提取大肠杆菌质粒 | 第43-44页 |
| 2.2.8.7 TOPO克隆构建入门载体 | 第44页 |
| 2.2.8.8 LR重组反应 | 第44页 |
| 2.2.9 DNA甲基化检测 | 第44-47页 |
| 2.2.9.1 植物基因组DNA的提取 | 第44-45页 |
| 2.2.9.2 亚硫酸氢钠修饰基因组DNA | 第45-46页 |
| 2.2.9.3 PCR反应和测序 | 第46-47页 |
| 2.2.10 GUS染色 | 第47页 |
| 2.2.10.1 组织的固定 | 第47页 |
| 2.2.10.2 染色 | 第47页 |
| 2.2.10.3 透明化处理 | 第47页 |
| 2.2.11 酵母双杂交验证蛋白相互作用 | 第47-49页 |
| 2.2.11.1 载体的构建 | 第47-48页 |
| 2.2.11.2 酵母感受态的制作 | 第48页 |
| 2.2.11.3 酵母的转化 | 第48页 |
| 2.2.11.4 相互作用的观察 | 第48-49页 |
| 2.2.12 双分子荧光互补验证蛋白相互作用 | 第49页 |
| 2.2.12.1 载体构建及农杆菌转化 | 第49页 |
| 2.2.12.2 烟草瞬时表达 | 第49页 |
| 2.2.13 农杆菌介导的拟南芥转基因 | 第49-50页 |
| 2.2.14 染色体免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP) | 第50-53页 |
| 2.2.14.1 材料准备 | 第50页 |
| 2.2.14.2 细胞核提取 | 第50-51页 |
| 2.2.14.3 超声 | 第51页 |
| 2.2.14.4 Pre-clear和IP | 第51-52页 |
| 2.2.14.5 Wash和洗脱 | 第52页 |
| 2.2.14.6 解交联 | 第52页 |
| 2.2.14.7 DNA纯化 | 第52-53页 |
| 2.2.15 分离染色质组分和细胞核核质组分的RNA | 第53-54页 |
| 2.2.15.1 细胞核提取 | 第53页 |
| 2.2.15.2 细胞核裂解 | 第53-54页 |
| 2.2.15.3 RNA 的提取 | 第54页 |
| 2.2.15.4 反转录及半定量PCR | 第54页 |
| 2.2.16 Western Blot检测蛋白表达 | 第54-56页 |
| 第三章 实验结果与讨论 | 第56-92页 |
| 3.1 实验结果 | 第56-88页 |
| 3.1.1 XCT通过调节DCL基因的表达影响sRNA的合成 | 第56-70页 |
| 3.1.1.1 amiR-triOX转基因系的建立及突变体的筛选 | 第56页 |
| 3.1.1.2 cma33突变体的分离及鉴定 | 第56-61页 |
| 3.1.1.3 xct突变体与miRNA通路已知突变体的遗传分析 | 第61-62页 |
| 3.1.1.4 xct突变影响miRNA的产生 | 第62-64页 |
| 3.1.1.5 xct突变体中hc-siRNA和ta-siRNA的积累也受到影响 | 第64-66页 |
| 3.1.1.6 xct突变体中DCL1、DCL3和DCL4的表达量下降 | 第66-68页 |
| 3.1.1.7 xct突变体中PolⅡ在DCL1、DCL3和DCL4区域的结合减少 | 第68-70页 |
| 3.1.2 植物Elongator复合物偶联MIR转录和Pri-miRNA加工的机理研究 | 第70-88页 |
| 3.1.2.1 soe突变体的筛选 | 第70页 |
| 3.1.2.2 soe1和soe2突变体的分离及鉴定 | 第70-74页 |
| 3.1.2.3 Elongator复合体正调节miRNA的积累 | 第74-77页 |
| 3.1.2.4 Elongator促进MIR的转录 | 第77-80页 |
| 3.1.2.5 Elongator与pri-miRNA加工因子相互作用 | 第80-83页 |
| 3.1.2.6 Elongator的缺失影响DCL1的定位 | 第83-84页 |
| 3.1.2.7 Pri-miRNA转录本和DCL1与富集在染色体上 | 第84-87页 |
| 3.1.2.8 DCL1与染色体的相互作用依赖于Elongator复合物 | 第87-88页 |
| 3.2 讨论 | 第88-92页 |
| 3.2.1 XCT调节sRNA通路的研究 | 第88-90页 |
| 3.2.2 植物Elongator复合物偶联MIR转录和Pri-miRNA加工的机理研究 | 第90-92页 |
| 参考文献 | 第92-105页 |
| 附录 | 第105-118页 |
| 攻读博士期间发表的论文 | 第118-119页 |
| 致谢 | 第119-121页 |
