| 中文摘要 | 第1-14页 |
| 英文摘要 | 第14-20页 |
| 第一章 人端粒酶催化亚基(hTERT)的研究现状和研究进展（文献综述） | 第20-59页 |
| 1. 端粒与端粒酶 | 第20-25页 |
| ·端粒的结构及其功能 | 第20-22页 |
| ·端粒酶的结构及其功能 | 第22-25页 |
| ·端粒酶RNA(hTR) | 第22-23页 |
| ·端粒酶相关蛋白(TP1、TP2、TRF1、TRF2) | 第23-24页 |
| ·端粒酶催化亚单位(hTERT) | 第24-25页 |
| 2. 基于hTERT亚单位的端粒酶活性调控 | 第25-29页 |
| 3. 端粒、端粒酶与细胞衰老、长寿的关系 | 第29-31页 |
| ·端粒酶依赖的端粒延长机制(TA型) | 第29页 |
| ·端粒替代延长机制(ALT 型) | 第29-31页 |
| 4. 端粒酶催化亚基(hTERT)与细胞永生化 | 第31-33页 |
| 5. 永生化细胞在组织工程中的应用前景 | 第33-34页 |
| 6. 细胞基因转染的常用方法 | 第34-35页 |
| 7. 慢病毒及其优点 | 第35-36页 |
| 8. 端粒酶在卵巢肿瘤诊断和鉴别诊断中的作用 | 第36-39页 |
| ·端粒酶活性与卵巢肿瘤组织良恶性的判断 | 第37页 |
| ·端粒酶的活性与卵巢肿瘤的细胞分化和转移 | 第37-38页 |
| ·端粒酶活性与卵巢肿瘤患者的预后 | 第38页 |
| ·端粒酶各组分基因表达与临床病理的关系 | 第38-39页 |
| 9. 基于核酸适体纳米金探针催化的DNA杂交共振散射光谱检测 | 第39-42页 |
| ·测定端粒重复片段长度方法现状研究 | 第39-40页 |
| ·金纳米粒子的性质、制备、表征及分析应用 | 第40-42页 |
| ·金纳米微粒的性质 | 第40-41页 |
| ·金纳米微粒的制备 | 第41-42页 |
| 10. 共振散射技术的理论基础、特点、分析应用及发展前景 | 第42-44页 |
| ·共振散射技术的理论基础 | 第42-43页 |
| ·共振散射光谱法的特点 | 第43页 |
| ·共振散射光谱法在核酸分析中的应用 | 第43-44页 |
| 11. DNA 杂交的研究进展 | 第44-47页 |
| ·DNA 的化学结构 | 第44-45页 |
| ·DNA 的碱基配对原则 | 第45页 |
| ·DNA 的杂交 | 第45-46页 |
| ·基于核酸适体纳米金探针催化的DNA 杂交 | 第46-47页 |
| 12. 本研究的目地和意义 | 第47-48页 |
| 参考文献 | 第48-59页 |
| 第二章 过表达人端粒酶逆转录酶促进人脐静脉血管内皮细胞增殖实验流程 | 第59-100页 |
| 实验流程 | 第59-60页 |
| 1. 材料及试剂 | 第60-65页 |
| ·材料 | 第60-65页 |
| ·质粒与菌株、细胞 | 第60-61页 |
| ·实验主要仪器设备 | 第61-62页 |
| ·主要试剂 | 第62-63页 |
| ·部分试剂的配置 | 第63-65页 |
| ·引物的设计 | 第65页 |
| 2. 方法 | 第65-85页 |
| ·pEGFP-C1-hTERT 真核表达载体的构建 | 第65-73页 |
| ·大肠杆菌感受态细菌的制备 | 第66页 |
| ·pEGFP-C1 和pCI-neo-hTERT 质粒的样品准备 | 第66-68页 |
| ·pEGFP-C1和pCI-neo-hTERT质粒的双酶切及酶切产物凝胶回收 | 第68-69页 |
| ·pCI-neo-hTERT 质粒和载体pEGFP-C1 的双酶切反应体系 | 第68页 |
| ·酶切完全后电泳充分分离 | 第68页 |
| ·酶切产物的纯化与回收 | 第68-69页 |
| ·回收的PCR产物与pEGFP-C1载体连接 | 第69-70页 |
| ·连接产物转化至感受态DH-5α | 第70-71页 |
| ·挑选阳性克隆扩大培养 | 第71页 |
| ·质粒DNA的快速提取(碱裂解法) | 第71-72页 |
| ·检测连接是否成功 | 第72-73页 |
| ·双酶切鉴定 | 第72页 |
| ·测序 | 第72-73页 |
| ·测序结果序列分析 | 第73页 |
| ·脂质体法转染hUVEC细胞 | 第73-85页 |
| ·hUVEC 的培养和转染前的处理 | 第74-75页 |
| ·hTERT 基因转染内皮细胞 | 第75-76页 |
| ·RT-PCR法检测转染后hTERT基因表达 | 第76-82页 |
| ·转染hUVEC总RNA提取 | 第76-77页 |
| ·总RNA的定量及纯度测定 | 第77页 |
| ·cDNA合成 | 第77-79页 |
| ·RT-PCR测定hTERT mRNA的表达 | 第79-82页 |
| ·转染重组质粒细胞端粒酶活性检测 | 第82-83页 |
| ·免疫组织化学法检测转染后hTERT 表达 | 第83-84页 |
| ·MTT法检测细胞生长增值情况 | 第84-85页 |
| 3. 结果 | 第85-95页 |
| ·pEGFP-C1-hTERT 重组质粒的质粒的鉴定 | 第85-90页 |
| ·转染pEGFP-C1-hTERT质粒后hUVEC荧光表达 | 第90-91页 |
| ·pEGFP-C1-hTERT 重组质粒转染hUVEC 细胞后hTERT mRNA 的表达 | 第91-92页 |
| ·转染hTERT基因细胞端粒酶蛋白的表达情况 | 第92-93页 |
| ·端粒酶活性检测 | 第93-94页 |
| ·hTERT 基因对内皮细胞的生长增殖的影响 | 第94-95页 |
| 4、讨论 | 第95-97页 |
| 结论 | 第97-98页 |
| 参考文献 | 第98-100页 |
| 第三章 构建携带重组人端粒酶逆转录酶第三代慢病毒载体及其病毒包装鉴定 | 第100-135页 |
| 实验流程 | 第101页 |
| 1. 材料及试剂 | 第101-117页 |
| ·材料 | 第101-107页 |
| ·质粒与细胞 | 第101-103页 |
| ·主要试剂 | 第103-104页 |
| ·主要试剂的配置 | 第104-106页 |
| ·实验主要仪器设备 | 第106-107页 |
| ·方法 | 第107-117页 |
| ·pCDH- hTERT 慢病毒表达载体的构建 | 第107-109页 |
| ·双酶切pCI-neo-hTERT和pCDH-copGFP质粒 | 第107-108页 |
| ·酶切产物的纯化和回收 | 第108页 |
| ·插入片段hTERT与pCDH- copGFP线性质粒的连接 | 第108页 |
| ·连接产物转化DH5a 感受态 | 第108页 |
| ·挑取氨苄抗性阳性单克隆菌落，提取质粒进行鉴定 | 第108-109页 |
| ·pCDH-hTERT的双酶切鉴定及测序分析 | 第109页 |
| ·携带hTERT基因重组慢病毒的包装与浓缩 | 第109-117页 |
| ·293T细胞的复苏及传代培养 | 第110页 |
| ·慢病毒包装 | 第110-111页 |
| ·含hTERT-GFP慢病毒颗粒上清液的收集及浓缩 | 第111页 |
| ·鉴定重组慢病毒的包装是否成功 | 第111页 |
| ·慢病毒的滴度测定 | 第111-112页 |
| ·重组慢病毒感染不同的细胞 | 第112-113页 |
| ·重组慢病毒pCDH- hTERT在靶细胞中的表达 | 第113-117页 |
| ·细胞分组方案 | 第113页 |
| ·RT-PCR检测转导重组慢病毒前后靶细胞端粒酶基因hTERT mRNA 的表达情况 | 第113页 |
| ·重组慢病毒感染293T及hUVEC后Western blotting检测hTERT蛋白的表达 | 第113-116页 |
| ·重组慢病毒感染靶细胞后端粒酶的活性检测 | 第116-117页 |
| ·统计学处理 | 第117页 |
| 2. 结果 | 第117-128页 |
| ·重组质粒pCDH- hTERT的鉴定 | 第117-122页 |
| ·包装细胞293T细胞转导pCDH-hTERT质粒后GFP的表达 | 第122-123页 |
| ·携带重组慢病毒的包装和病毒滴度的测定 | 第123-124页 |
| ·重组慢病毒介导hTERT基因感染不同的四种细胞后GFP的表达与感染效率 | 第124-125页 |
| ·重组慢病毒转导前后细胞端粒酶基因hTERT mRNA的表达 | 第125-127页 |
| ·Western blotting 检测感染hUVEC 细胞后hTERT 蛋白的表达 | 第127页 |
| ·端粒酶活性检测 | 第127-128页 |
| 3. 讨论 | 第128-131页 |
| 结论 | 第131-132页 |
| 参考文献 | 第132-135页 |
| 第四章 广西长寿物种端粒长度的检测与纳米金标记的巯基寡聚核苷酸探针快速灵敏检测端粒长度新方法的初探 | 第135-162页 |
| 实验流程 | 第136-137页 |
| 1. 材料及方法 | 第137-150页 |
| ·材料 | 第137-142页 |
| ·研究对象及分组 | 第137页 |
| ·不同长度端粒重复靶片段 | 第137-138页 |
| ·实验主要仪器设备 | 第138-139页 |
| ·主要试剂 | 第139-140页 |
| ·主要试剂的配制 | 第140-142页 |
| ·方法 | 第142-150页 |
| ·DNA提取 | 第142-143页 |
| ·DNA 浓度及纯度测定 | 第143页 |
| ·Southern杂交 | 第143-145页 |
| ·纳米金的制备 | 第145-146页 |
| ·金标记端粒探针（Au-SH-ssDNA）的制备 | 第146-150页 |
| ·端粒探针（SH-ssDNA）用量确定 | 第146页 |
| ·金标记端粒探针的制备 | 第146-147页 |
| ·金标记端粒探针与端粒标准品杂交反应 | 第147-150页 |
| 2. 结果 | 第150-155页 |
| ·DNA 提取质量（浓度及纯度）测定 | 第150页 |
| ·Southern 杂交检测不同物种端粒长度 | 第150-151页 |
| ·制备的胶体金的质量鉴定 | 第151页 |
| ·金标记端粒探针的用量确定 | 第151-152页 |
| ·实验条件的优化 | 第152-155页 |
| ·杂交反应条件的优化 | 第152-155页 |
| ·缓冲溶液的pH 影响 | 第152-153页 |
| ·Au-SH-ssDNA 浓度的影响 | 第153页 |
| ·NaCl 浓度的影响 | 第153-154页 |
| ·超声波辐照时间的影响 | 第154-155页 |
| ·改变杂交条件,配制不同的杂交液进行反应 | 第155页 |
| 3. 讨论 | 第155-159页 |
| 结论 | 第159-160页 |
| 参考文献 | 第160-162页 |
| 英文缩略词表 | 第162-164页 |
| 致谢 | 第164-165页 |
| 攻读学位期间参与的课题及发表的学术论文 | 第165页 |
