| 致谢 | 第5-6页 |
| 摘要 | 第6-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 缩略词表 | 第9-13页 |
| 第1章 绪论 | 第13-23页 |
| 1.1 β-内酰胺类抗生素简介及分类 | 第13-14页 |
| 1.2 β-内酰胺类抗生素耐药机理 | 第14-15页 |
| 1.3 β-内酰胺酶分类 | 第15-19页 |
| 1.4 青霉素酶 | 第19-20页 |
| 1.5 青霉素酶活性检测方法 | 第20-21页 |
| 1.6 选题的意义及研究内容 | 第21-23页 |
| 第2章 青霉素酶TEM-1表达载体的构建 | 第23-35页 |
| 2.1 引言 | 第23页 |
| 2.2 实验材料及仪器设备 | 第23-25页 |
| 2.2.1 菌种及载体 | 第23页 |
| 2.2.2 药品试剂 | 第23页 |
| 2.2.3 主要仪器及型号 | 第23-24页 |
| 2.2.4 实验溶液配制 | 第24-25页 |
| 2.3 实验方法 | 第25-29页 |
| 2.3.1 大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第25-26页 |
| 2.3.2 重组青霉素酶TEM-1基因的克隆及表达质粒构建 | 第26页 |
| 2.3.3 重组pET22b-penp质粒的转化 | 第26-27页 |
| 2.3.4 阳性克隆菌鉴定 | 第27-28页 |
| 2.3.5 目的蛋白的SDS-PAGE分析 | 第28-29页 |
| 2.4 结果及讨论 | 第29-33页 |
| 2.4.1 青霉素酶TEM-1基因序列合成 | 第29-32页 |
| 2.4.2 pET22b-penp表达载体构建及鉴定 | 第32-33页 |
| 2.5 本章小结 | 第33-35页 |
| 第3章 青霉素酶TEM-1的表达及纯化 | 第35-52页 |
| 3.1 引言 | 第35页 |
| 3.2 实验材料及仪器设备 | 第35-38页 |
| 3.2.1 菌种 | 第35页 |
| 3.2.2 药品试剂 | 第35页 |
| 3.2.3 主要仪器及型号 | 第35-37页 |
| 3.2.4 实验溶液配制 | 第37-38页 |
| 3.3 实验方法 | 第38-42页 |
| 3.3.1 青霉素酶TEM-1发酵表达工艺 | 第38-39页 |
| 3.3.1.1 菌种库的建立 | 第38页 |
| 3.3.1.2 种子培养 | 第38页 |
| 3.3.1.3 发酵培养 | 第38-39页 |
| 3.3.2 青霉素酶TEM-1纯化工艺 | 第39-40页 |
| 3.3.2.1 包涵体的制备及目的蛋白复性 | 第39页 |
| 3.3.2.2 复性蛋白纯化 | 第39-40页 |
| 3.3.3 青霉素酶TEM-1纯化蛋白检测 | 第40-42页 |
| 3.3.3.1 蛋白浓度检测 | 第40-41页 |
| 3.3.3.2 SDS-PAGE电泳检测 | 第41页 |
| 3.3.3.3 酶活性检测 | 第41页 |
| 3.3.3.4 蛋白纯度检测 | 第41-42页 |
| 3.4 结果与讨论 | 第42-51页 |
| 3.4.1 青霉素酶TEM-1的发酵表达优化 | 第42-46页 |
| 3.4.1.1 发酵培养基优化 | 第42-43页 |
| 3.4.1.2 补料培养基优化 | 第43-44页 |
| 3.4.1.3 诱导时间优化 | 第44-45页 |
| 3.4.1.4 诱导剂浓度优化 | 第45-46页 |
| 3.4.1.5 发酵过程 | 第46页 |
| 3.4.2 青霉素酶TEM-1包涵体的洗涤与变性 | 第46-48页 |
| 3.4.2.1 目标蛋白表达状态分析 | 第46-47页 |
| 3.4.2.2 包涵体的洗涤 | 第47页 |
| 3.4.2.3 包涵体裂解 | 第47-48页 |
| 3.4.3 青霉素酶TEM-1蛋白复性 | 第48-49页 |
| 3.4.3.1 复性方式选择 | 第48页 |
| 3.4.3.2 复性液蛋白浓度选择 | 第48-49页 |
| 3.4.3.3 复性pH选择 | 第49页 |
| 3.4.4 青霉素酶TEM-1蛋白分离纯化 | 第49-51页 |
| 3.5 本章小结 | 第51-52页 |
| 第4章 青霉素酶TEM-1活性检测方法比较 | 第52-59页 |
| 4.1 引言 | 第52页 |
| 4.2 实验材料及仪器设备 | 第52-54页 |
| 4.2.1 实验材料 | 第52页 |
| 4.2.2 药品试剂 | 第52页 |
| 4.2.3 主要仪器及型号 | 第52-53页 |
| 4.2.4 实验溶液配制 | 第53-54页 |
| 4.3 实验方法 | 第54-56页 |
| 4.3.1 碘量法测定青霉素酶活性 | 第54页 |
| 4.3.2 羟胺法测定青霉素酶活性 | 第54-55页 |
| 4.3.3 精密度实验 | 第55-56页 |
| 4.4 结果与讨论 | 第56-57页 |
| 4.4.1 标准曲线的绘制 | 第56-57页 |
| 4.4.2 精密度实验结果 | 第57页 |
| 4.5 本章小结 | 第57-59页 |
| 第5章 青霉素酶TEM-1酶学性质及功效 | 第59-68页 |
| 5.1 引言 | 第59页 |
| 5.2 实验材料及仪器设备 | 第59-61页 |
| 5.2.1 实验材料 | 第59页 |
| 5.2.2 药品试剂 | 第59页 |
| 5.2.3 主要仪器及型号 | 第59-60页 |
| 5.2.4 实验溶液配制 | 第60-61页 |
| 5.3 实验方法 | 第61-63页 |
| 5.3.1 青霉素酶TEM-1最适反应pH | 第61页 |
| 5.3.2 青霉素酶TEM-1最适反应温度 | 第61页 |
| 5.3.3 青霉素酶TEM-1 pH稳定性 | 第61-62页 |
| 5.3.4 青霉素酶TEM-1温度稳定性 | 第62页 |
| 5.3.5 青霉素酶TEM-1辅料稳定性 | 第62页 |
| 5.3.6 青霉素酶TEM-1功效检测 | 第62-63页 |
| 5.3.6.1 功效检测方法一 | 第62-63页 |
| 5.3.6.2 功效检测方法二 | 第63页 |
| 5.4 结果和讨论 | 第63-67页 |
| 5.4.1 青霉素酶TEM-1最适反应pH | 第63页 |
| 5.4.2 青霉素酶TEM-1最适反应温度 | 第63-64页 |
| 5.4.3 青霉素酶TEM-1 pH稳定性 | 第64页 |
| 5.4.4 青霉素酶TEM-1温度稳定性 | 第64-65页 |
| 5.4.5 青霉素酶TEM-1辅料稳定性 | 第65页 |
| 5.4.6 青霉素酶TEM-1功效检测 | 第65-67页 |
| 5.4.6.1 功效检测方法一 | 第65-66页 |
| 5.4.6.2 功效检测方法二 | 第66-67页 |
| 5.5 本章小结 | 第67-68页 |
| 全文总结 | 第68-70页 |
| 参考文献 | 第70-72页 |