| 致谢 | 第1-13页 |
| 摘要 | 第13-15页 |
| Abstract | 第15-17页 |
| 第一章 文献综述 | 第17-38页 |
| 第一节 双生病毒致病分子机理研究进展 | 第17-29页 |
| 1. 双生病毒的分类及其基因组结构 | 第17-21页 |
| ·菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus) | 第17-19页 |
| ·玉米线条病毒属(Mastrevirus) | 第19页 |
| ·甜菜曲顶病毒属(Curtovirus) | 第19-20页 |
| ·番茄伪曲顶病毒属(Topocuvirus) | 第20-21页 |
| 2. 与双生病毒相伴随的卫星DNA | 第21-24页 |
| ·Alphasatellite | 第21页 |
| ·Betasatellite | 第21-24页 |
| 3. 双生病毒编码的蛋白及功能 | 第24-27页 |
| ·外壳蛋白CP | 第24-25页 |
| ·包壳和传毒 | 第24-25页 |
| ·CP在细胞核内定位,结合并运送DNA进出细胞核 | 第25页 |
| ·复制蛋白Rep | 第25-27页 |
| ·Rep蛋白的结构非常保守 | 第25-26页 |
| ·Rep蛋白是唯一一个双生病毒DNA复制必需的病毒蛋白 | 第26页 |
| ·具有DNA连接酶和核酸内切酶活性,能够起始病毒链DNA合成 | 第26页 |
| ·Rep蛋白具有ATP酶活性 | 第26-27页 |
| ·双组份双生病毒编码的运动蛋白BC1和BV1 | 第27页 |
| 4. 双生病毒的致病因子及其可能的作用途径 | 第27-29页 |
| ·干扰细胞运动 | 第27-28页 |
| ·调控细胞周期 | 第28页 |
| ·抑制基因沉默 | 第28-29页 |
| 第二节 病毒编码的RNA沉默抑制子研究进展 | 第29-35页 |
| 1. RNA沉默的简介 | 第29-31页 |
| 2. 植物病毒编码的RNA沉默抑制子 | 第31页 |
| 3. RNA沉默抑制子的鉴定方法 | 第31-34页 |
| ·农杆菌共浸润法 | 第31-32页 |
| ·稳定表达法和嫁接法 | 第32-33页 |
| ·RNA沉默逆转法 | 第33-34页 |
| 4. RNA沉默抑制子的分子作用机理 | 第34-35页 |
| ·HC-Pro的分子作用机理 | 第34页 |
| ·P19的分子作用机理 | 第34-35页 |
| ·2b的分子作用机理 | 第35页 |
| 第三节 课题立项依据 | 第35-38页 |
| 第二章 材料与方法 | 第38-51页 |
| 1. 材料 | 第38页 |
| ·植物材料 | 第38页 |
| ·菌株和质粒 | 第38页 |
| ·试剂与仪器 | 第38页 |
| ·常用缓冲液的配制 | 第38页 |
| 2. 方法 | 第38-51页 |
| ·PCR技术体系 | 第38-40页 |
| ·普通PCR反应 | 第38-39页 |
| ·Overlap-PCR | 第39-40页 |
| ·PCR产物纯化 | 第40-41页 |
| ·DNA克隆 | 第41-43页 |
| ·载体的去磷酸化 | 第41页 |
| ·连接 | 第41-42页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第42页 |
| ·转化 | 第42-43页 |
| ·重组质粒的提取与鉴定 | 第43-45页 |
| ·碱裂解法 | 第43-44页 |
| ·质粒微量提取试剂盒 | 第44页 |
| ·PCR鉴定 | 第44页 |
| ·酶切鉴定 | 第44-45页 |
| ·SDS-PAGE与Western印迹分析 | 第45-47页 |
| ·植物可溶性蛋白样品的制备 | 第45页 |
| ·蛋白质含量测定(Bradford法) | 第45页 |
| ·SDS-PAGE | 第45-46页 |
| ·电转移 | 第46页 |
| ·Western印迹分析 | 第46-47页 |
| ·酶联免疫吸附剂测定(ELISA) | 第47页 |
| ·植物总RNA提取和Northern印迹分析 | 第47-51页 |
| ·器皿和容器的处理 | 第47-48页 |
| ·植物总RNA的提取 | 第48页 |
| ·甲醛变性凝胶电泳 | 第48-49页 |
| ·RNA转膜 | 第49页 |
| ·预杂交和杂交 | 第49-51页 |
| 第三章 小麦矮缩病毒基因的克隆及其致病性研究 | 第51-66页 |
| 1 材料与方法 | 第51-56页 |
| ·植物材料 | 第51页 |
| ·质粒和菌株 | 第51-52页 |
| ·重组PVX病毒表达载体的构建 | 第52-54页 |
| ·构建含有候选WDV编码基因的重组PVX病毒表达载体 | 第52-53页 |
| ·构建含有WDV Rep缺失突变体的重组PVX病毒表达载体 | 第53-54页 |
| ·电击转化农杆菌 | 第54-55页 |
| ·农杆菌介导的植株接种 | 第55页 |
| ·用DAB吸收法分析H_2O_2含量 | 第55-56页 |
| ·ELISA(酶联免疫吸附剂测定)方法检测浸润植株中PVX的病毒含量 | 第56页 |
| ·植物可溶性总蛋白样品的制备 | 第56页 |
| ·SDS-PAGE电泳和Western印迹分析 | 第56页 |
| 2. 结果与分析 | 第56-63页 |
| ·WDV编码的4个候选基因的克隆以及序列测定 | 第56-57页 |
| ·WDV编码的Rep蛋白在PVX异源表达系统中是症状决定因子 | 第57-60页 |
| ·分析Rep突变体对致病性的影响 | 第60-63页 |
| 3. 讨论 | 第63-66页 |
| 第四章 WDV编码的RNA沉默抑制子及其作用机制 | 第66-90页 |
| 1 材料与方法 | 第66-74页 |
| ·植物材料 | 第66页 |
| ·质粒和菌株 | 第66-67页 |
| ·载体构建 | 第67-70页 |
| ·构建重组表达载体pCHF3-V1/V2/RepA/Rep | 第67页 |
| ·构建含有Rep突变体的重组pCHF3载体 | 第67页 |
| ·构建用于亚细胞定位的Rep及其突变体的表达载体 | 第67-68页 |
| ·含有MBP标签的Rep蛋白原核表达载体构建 | 第68页 |
| ·含有Rep蛋白的BiFC表达载体构建 | 第68-70页 |
| ·农杆菌瞬时表达沉默诱导体系的建立以及浸润 | 第70-71页 |
| ·农杆菌共浸润接种(Agroinfiltration) | 第71页 |
| ·GFP荧光观察结果和拍照 | 第71-72页 |
| ·沉默抑制子信号传导的浸润方法 | 第72页 |
| ·重组蛋白的原核表达及在自然条件下的大量纯化 | 第72-73页 |
| ·pMBP28-Rep蛋白的原核表达及纯化 | 第72-73页 |
| ·蛋白质含量测定(Bio-Rad protein Assay) | 第73页 |
| ·电泳迁移率变动试验(EMSA) | 第73-74页 |
| ·Rep蛋白的亚细胞定位 | 第74页 |
| 2 结果与分析 | 第74-88页 |
| ·WDV编码的Rep能抑制GFP 16c转基因本氏烟的局部沉默 | 第74-77页 |
| ·WDV Rep突变体对抑制局部基因沉默的作用 | 第77页 |
| ·WDV编码的Rep蛋白能抑制GFP 16c转基因本氏烟的GFP基因系统沉默 | 第77-79页 |
| ·WDV编码的Rep突变体对抑制系统沉默没有影响 | 第79-81页 |
| ·WDV编码的Rep蛋白能抑制GFP 16c本氏烟的GFP基因系统沉默信号的传导 | 第81-84页 |
| ·WDV编码的Rep蛋白与GFP RNA的结合特性 | 第84-85页 |
| ·WDV编码的Rep蛋白在本氏烟叶片表皮细胞中的亚细胞定位 | 第85-86页 |
| ·利用双分子荧光互补实验分析Rep蛋白在寄主体内的相互作用 | 第86-88页 |
| 3. 讨论 | 第88-90页 |
| 本研究小结 | 第90-91页 |
| 参考文献 | 第91-102页 |
| 附录A：本论文中所用病毒缩写及中英文对照 | 第102-103页 |
| 附录B：本论文中所用术语缩写与中英文对照 | 第103-105页 |
| 附录C：常用化学试剂、分子生物学试剂及厂商 | 第105-107页 |
| 附录D：常用缓冲液及培养基配方 | 第107-114页 |
| 硕士期间投稿和录用的文章 | 第114页 |
