| 摘要 | 第1-9页 |
| Abstract | 第9-11页 |
| 第一章 绪论 | 第11-27页 |
| 1 果胶和果胶酶 | 第11-22页 |
| ·果胶 | 第11-13页 |
| ·果胶酶及其研究概况 | 第13-20页 |
| ·果胶酸酯裂解酶 | 第16-17页 |
| ·果胶酸裂解酶 | 第17-19页 |
| ·果胶酸水解酶 | 第19-20页 |
| ·果胶酶的应用 | 第20-22页 |
| 2 大肠杆菌原核表达系统 | 第22-24页 |
| ·表达系统 | 第22-23页 |
| ·表达载体 | 第23-24页 |
| 3 本文的研究内容、目标及意义 | 第24-27页 |
| ·本论文研究目的 | 第24页 |
| ·本论文研究方法 | 第24-25页 |
| ·本论文研究意义 | 第25-27页 |
| 第二章 构巢曲霉果胶酸裂解酶(Pel A)在E.coli重组表达研究 | 第27-61页 |
| 第一节 构巢曲霉果胶酸裂解酶(Pel A)的基因克隆 | 第28-39页 |
| 1 材料与方法 | 第28-36页 |
| ·材料 | 第28-29页 |
| ·菌种 | 第28页 |
| ·质粒 | 第28页 |
| ·培养基 | 第28-29页 |
| ·主要试剂及来源 | 第29-30页 |
| ·主要仪器设备及其来源 | 第30页 |
| ·方法 | 第30-36页 |
| ·Aspergillus nidulans总RNA的提取 | 第30-32页 |
| ·RT-PCR方法合成Aspergillus nidulans cDNA | 第32页 |
| ·引物设计与合成 | 第32-33页 |
| ·不含信号肽的PelA cDNA的PCR扩增 | 第33页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳胶回收DNA片段 | 第33-34页 |
| ·TB法(Terrific Broth)抽提质粒 | 第34页 |
| ·CaCl_2法制备感受态细胞 | 第34-35页 |
| ·DNA连接反应 | 第35页 |
| ·感受态细胞的热激转化和稀释涂布 | 第35页 |
| ·重组菌的筛选和鉴定 | 第35页 |
| ·Pel A进化树的构建方法 | 第35-36页 |
| 2 结果与讨论 | 第36-39页 |
| ·构巢曲霉基因组RNA提取 | 第36页 |
| ·目的基因pel a cDNA的克隆和序列分析 | 第36-37页 |
| ·重组质粒pET-28a(+)-pel A及重组菌pET-28a(+)-pel A-Turner plac Ⅰ(DE3)的构建 | 第37页 |
| ·Pel A的系统发生关系 | 第37-39页 |
| 第二节 Pel A的原核重组表达及其分离纯化 | 第39-49页 |
| 1 材料与方法 | 第39-45页 |
| ·材料 | 第39-40页 |
| ·菌种 | 第39页 |
| ·培养基 | 第39-40页 |
| ·主要试剂及来源 | 第40-41页 |
| ·主要仪器设备及其来源 | 第41页 |
| ·方法 | 第41-45页 |
| ·重组菌的诱导表达 | 第41-42页 |
| ·粗蛋白的制备 | 第42页 |
| ·亲和层析纯化带有Histag标签的目的蛋白 | 第42-43页 |
| ·透析法将初步纯化的重组酶进一步提纯 | 第43页 |
| ·双键法测定PelA蛋白裂解酶活性 | 第43-44页 |
| ·蛋白浓度测定 | 第44页 |
| ·SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE) | 第44-45页 |
| 2 结果与讨论 | 第45-49页 |
| ·重组酶Pel A在E.coli中的重组表达 | 第45-48页 |
| ·重组酶Pel A粗酶液的分离与纯化 | 第48-49页 |
| 第三节 Pel A的酶学性质研究 | 第49-58页 |
| 1 材料与方法 | 第49-53页 |
| ·材料 | 第49-50页 |
| ·菌种 | 第49页 |
| ·培养基 | 第49-50页 |
| ·主要试剂及来源 | 第50-51页 |
| ·主要仪器设备及其来源 | 第51页 |
| ·方法 | 第51-53页 |
| ·重组菌的表达及其分离纯化 | 第51页 |
| ·蛋白浓度测定 | 第51页 |
| ·重组酶PelA分子量测定 | 第51-52页 |
| ·重组酶PelA对细胞壁多糖的底物特异性检测 | 第52页 |
| ·pH对酶活力的影响 | 第52页 |
| ·温度对酶活力的影响 | 第52页 |
| ·金属离子对酶活力的影响 | 第52页 |
| ·酶的动力学参数测定 | 第52-53页 |
| ·组织离析实验 | 第53页 |
| 2.结果与讨论 | 第53-58页 |
| ·重组酶Pel A的分子量大小 | 第53页 |
| ·重组酶PelA对细胞壁多糖的底物特异性检测 | 第53-54页 |
| ·重组酶Pel A等电点 | 第54页 |
| ·重组酶Pel A最适反应pH | 第54-55页 |
| ·重组酶Pel A最适反应温度 | 第55页 |
| ·重组酶Pel A pH稳定性 | 第55-56页 |
| ·重组酶Pel A温度稳定性 | 第56页 |
| ·金属离子和EDTA对重组酶0.5ml活力的影响 | 第56-57页 |
| ·重组酶PelA的米氏常数Km及最大酶反应速度Vmax的测定 | 第57页 |
| ·组织离析 | 第57-58页 |
| 第四节 本章小结 | 第58-61页 |
| 第三章 米曲霉果胶酸内切水解酶(PGA)在E.coli中重组表达研究 | 第61-85页 |
| 第一节 米曲霉果胶酸内切水解酶(PGA)的基因克隆 | 第62-71页 |
| 1 材料与方法 | 第62-69页 |
| ·材料 | 第62-63页 |
| ·菌种 | 第62页 |
| ·质粒 | 第62页 |
| ·培养基 | 第62-63页 |
| ·主要试剂及来源 | 第63-64页 |
| ·主要仪器设备及其来源 | 第64页 |
| ·方法 | 第64-69页 |
| ·Aspergillus oryzae总RNA的提取 | 第64-66页 |
| ·RT-PCR方法合成Aspergillus oryzae cDNA | 第66页 |
| ·引物设计与合成 | 第66-67页 |
| ·不含信号肽的PGA cDNA的PCR扩增 | 第67页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳胶回收DNA片段 | 第67-68页 |
| ·TB法抽提质粒 | 第68页 |
| ·CaCl_2法制备感受态细胞 | 第68页 |
| ·DNA连接反应 | 第68页 |
| ·感受态细胞的热激转化和稀释涂布 | 第68-69页 |
| ·重组菌的筛选和鉴定 | 第69页 |
| 2 结果与讨论 | 第69-71页 |
| ·米曲霉基因组RNA提取 | 第69页 |
| ·目的基因pgA cDNA的克隆和序列分析 | 第69-71页 |
| ·重组质粒pET-28a (+)-pgA及重组菌pET-28a (+)-pgA-Turner plac Ⅰ(DE3)的构建 | 第71页 |
| 第二节 PGA的原核重组表达及其酶学性质研究 | 第71-82页 |
| 1 材料与方法 | 第72-77页 |
| ·材料 | 第72页 |
| ·菌种 | 第72页 |
| ·培养基 | 第72页 |
| ·主要试剂及来源 | 第72-74页 |
| ·主要仪器设备及其来源 | 第74页 |
| ·方法 | 第74-77页 |
| ·重组菌的诱导表达 | 第74-75页 |
| ·粗蛋白的制备 | 第75页 |
| ·亲和层析初步纯化带有Histag标签的目的蛋白PGA | 第75页 |
| ·透析法将初步纯化的重组酶PGA进一步提纯 | 第75页 |
| ·测还原糖法测定PGA蛋白水解酶活性 | 第75-76页 |
| ·蛋白浓度测定 | 第76-77页 |
| ·SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE) | 第77页 |
| ·重组酶PGA对细胞壁多糖的底物特异性检测 | 第77页 |
| ·重组酶PGA最适反应条件测定 | 第77页 |
| ·金属离子对酶活力的影响 | 第77页 |
| ·组织离析实验 | 第77页 |
| 2 结果与分析 | 第77-82页 |
| ·重组酶PGA在E.coli中的重组表达 | 第78-80页 |
| ·重组酶PGA对细胞壁多糖的底物特异性检测 | 第80-81页 |
| ·重组酶PGA的最适反应条件 | 第81页 |
| ·金属离子对重组酶PGA活力的影响 | 第81-82页 |
| ·组织离析 | 第82页 |
| 第三节 本章小结 | 第82-85页 |
| 参考文献 | 第85-98页 |
| 附录1 | 第98-99页 |
| 附录2 | 第99-101页 |
| 附录3 | 第101-103页 |
| 致谢 | 第103页 |
