| 摘要 | 第1-9页 |
| ABSTRACT | 第9-19页 |
| 第一章 文献综述 | 第19-46页 |
| ·生物体内DNA的修饰类型检测方法和相关生理意义 | 第19-33页 |
| ·天然状态下生物体内DNA修饰的类型 | 第19-22页 |
| ·DNA甲基化修饰的检测方法与策略 | 第22-26页 |
| ·DNA修饰的生理意义 | 第26-33页 |
| ·与染色体的复制相关 | 第27-28页 |
| ·DamMT调控基因表达范例之一 | 第28-31页 |
| ·DNA的甲基化修饰-限制系统 | 第31-32页 |
| ·由DNA甲基化所调控的其它生理过程 | 第32-33页 |
| ·DNA甲基化修饰所涉及分子事件的模型 | 第33页 |
| ·与已知DNA修饰类型不同的DNA磷硫酰化修饰 | 第33-43页 |
| ·脉冲场凝胶电泳与DNA新型磷硫酰化修饰的发现 | 第33-38页 |
| ·DNA磷硫酰化修饰的化学性质 | 第38-41页 |
| ·磷硫酰化修饰DNA的分子生物学研究 | 第41-42页 |
| ·dnd基因的分子遗传学研究 | 第42-43页 |
| ·Dnd现象的生物学意义的探索 | 第43页 |
| ·本研究工作的目的与意义 | 第43-46页 |
| ·建立鉴定DNA磷硫酰化修饰表型的简单、稳定、快速方法 | 第44页 |
| ·DNA磷硫酰化修饰突变株的表型鉴定分析 | 第44-45页 |
| ·定位磷硫酰化修饰的DNA的位点和共有顺序 | 第45页 |
| ·dnd基因簇的转录分析 | 第45页 |
| ·DNA磷硫酰化修饰的生物化学工作基础准备 | 第45页 |
| ·DNA磷硫酰化修饰的生理意义初探 | 第45-46页 |
| 第二章 实验材料和方法 | 第46-69页 |
| ·实验材料 | 第46-54页 |
| ·菌株 | 第46-47页 |
| ·质粒 | 第47-51页 |
| ·培养基和化学试剂[69,70] | 第51-54页 |
| ·实验方法[71-77] | 第54-69页 |
| ·链霉菌培养及菌种保藏 | 第54页 |
| ·链霉菌原生质体的制备及DNA转化 | 第54-55页 |
| ·质粒DNA的提取 | 第55页 |
| ·大肠杆菌质粒DNA的小量提取 | 第55页 |
| ·大肠杆菌和链霉菌质粒DNA的少量快速提取及检测(快检) | 第55页 |
| ·链霉菌质粒的大量提取 | 第55页 |
| ·链霉菌总DNA的少量快速提取 | 第55-56页 |
| ·DNA片段的回收(GENE CLEAN试剂盒) | 第56页 |
| ·两亲本杂交介导的质粒DNA的跨属转移(适合于变铅链霉菌及衍生菌株[78-80]；本研究) | 第56-57页 |
| ·链霉菌菌丝体包埋Plugs的制备、提取完整DNA 、激活Plug中的DNA和PFGE电泳 | 第57-58页 |
| ·激活的各片段的克隆、断点处核苷酸序列的测序 | 第58-59页 |
| ·系统性定点突变优先修饰位点的保守核苷酸序列构建过程 | 第59-61页 |
| ·用于回补的dndB基因的构建 | 第61-63页 |
| ·聚合酶链式反应扩增目的片段 | 第63页 |
| ·无DNase处理的RNA提取方法 | 第63-64页 |
| ·一步法RT-PCR的反应体系和反应条件 | 第64-65页 |
| ·用Lic载体构建目的基因 | 第65-66页 |
| ·以pET44-b为表达载体对dnd系列基因的克隆构建 | 第66-67页 |
| ·蛋白质的诱导表达 | 第67-68页 |
| ·纯化带有His-Tag标签的Dnd系列融合蛋白 | 第68页 |
| ·生物信息学分析 | 第68-69页 |
| 第三章 建立鉴定简单、稳定、快速的DNA磷硫酰化修饰表型方法 | 第69-81页 |
| ·前言 | 第69-70页 |
| ·结果与分析 | 第70-79页 |
| ·PAA-TAE与电泳激活缓冲液对质粒pHZ209切割的比较 | 第70-72页 |
| ·PAA-TAE使用浓度优化 | 第72-73页 |
| ·PAA-TAE处理时间的优化 | 第73-74页 |
| ·Salmonella 87菌株磷硫酰化质粒的位点专化性Dnd表型鉴定 | 第74-77页 |
| ·Salmonella 87菌株磷硫酰化基因簇Salm-dndBCDE 在DH10B中表达后质粒的Dnd表型鉴定 | 第77页 |
| ·PAA-TAE对低熔点琼脂糖包埋的菌丝体基因组DNA的切割 | 第77-79页 |
| ·讨论 | 第79-81页 |
| 第四章 DNA磷硫酰化修饰基因的生物信息学分析及相关菌株的表型鉴定 | 第81-100页 |
| ·前言 | 第81-82页 |
| ·结果和分析 | 第82-97页 |
| ·dnd各基因生物信息学分析 | 第82-87页 |
| ·DndA蛋白的生物信息学分析 | 第82-83页 |
| ·DndB蛋白的生物信息学分析 | 第83-85页 |
| ·DndC蛋白的生物信息学分析 | 第85页 |
| ·DndD蛋白的生物信息学分析 | 第85-86页 |
| ·DndE蛋白的生物信息学分析 | 第86-87页 |
| ·磷硫酰化修饰系列菌株Dnd表型鉴定 | 第87-97页 |
| ·S. lividans和系列突变株基因组DNA的Dnd表型鉴定 | 第87-89页 |
| ·对HXY6和获得的其系列整合型突变株基因组DNA的Dnd表型鉴定 | 第89-91页 |
| ·dnd基因回补突变株的表型鉴定 | 第91-92页 |
| ·对Salmonella enterica和P. fluorescens PfO-1总DNA的Dnd表型鉴定 | 第92-93页 |
| ·Streptomyces lividans 66的dnd基因簇在姊妹菌株Streptomyces coelicolor中的表达情况 | 第93-96页 |
| ·Dnd现象在生物间的存在情况 | 第96-97页 |
| ·讨论 | 第97-100页 |
| 第五章 DNA磷硫酰化修饰位点的特异性选择的研究 | 第100-113页 |
| ·前言 | 第100-101页 |
| ·结果与分析 | 第101-110页 |
| ·野生型1326和dnd系列突变株质粒降解表型呈现有规律的带型 | 第101-103页 |
| ·野生型1326 和其dndB突变株HXY2降解带型差异分析 | 第103-104页 |
| ·激活的各片段的克隆、断点处核苷酸序列的测序及分析 | 第104-107页 |
| ·系统性定点突变优先修饰位点的保守核苷酸序列 | 第107-108页 |
| ·检测突变后的优先修饰位点在野生型1326和dndB突变菌株HXY2中的降解表型 | 第108-109页 |
| ·每个质粒最多修饰一次 | 第109-110页 |
| ·讨论 | 第110-113页 |
| 第六章 DNA磷硫酰化修饰的优先性决定因素的初探 | 第113-125页 |
| ·前言 | 第113页 |
| ·结果和分析 | 第113-123页 |
| ·突变质粒pJTU2003在野生菌1326和突变株HXY2中的Dnd表型检测 | 第113-114页 |
| ·dndB基因克隆的功能互补 | 第114-116页 |
| ·质粒pHZ209在回补菌株中的降解表现鉴定 | 第116页 |
| ·质粒pJTU2003在dndB系列基因回补菌株中的降解表现鉴定 | 第116-120页 |
| ·质粒pHZ209优先修饰保守区两翼序列的突变对优先修饰的影响 | 第120-122页 |
| ·对质粒pHZ209优先修饰区周围序列的分析 | 第122-123页 |
| ·讨论 | 第123-125页 |
| 第七章 RT-PCR法分析dnd磷硫酰化基因簇的转录表达 | 第125-134页 |
| ·前言 | 第125页 |
| ·结果和讨论 | 第125-132页 |
| ·dnd磷硫酰化基因簇RT-PCR引物设计 | 第125-127页 |
| ·各个菌株总RNA的提取和质量检测 | 第127页 |
| ·逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测dnd系列基因的mRNA转录情况 | 第127-129页 |
| ·dndB基因可能对dndA基因的转录有调控功能 | 第129-130页 |
| ·检测1326和HXY2在不同菌龄时的dndA，dndB和dndD的mRNA转录 | 第130-132页 |
| ·检测1326中的质粒pHZ209降解表型和不同转录时期的关系 | 第132页 |
| ·讨论 | 第132-134页 |
| 第八章 DndABCDE五个蛋白的可溶性表达 | 第134-146页 |
| ·前言 | 第134-135页 |
| ·结果和分析 | 第135-143页 |
| ·改造表达载体pET-156成为带有Strep-TagII 标签和Lic片段的克隆和表达通用载体 | 第135-136页 |
| ·含N-Strep-TagII 标签的dnd系列基因的诱导表达情况 | 第136-137页 |
| ·改造pIB139成为带有Strep-TagII标签的适合链霉菌中表达的载体 | 第137-138页 |
| ·以pET-446为表达载体对dnd基因进行克隆和表达 | 第138-142页 |
| ·以pET-446为表达载体对dndB蛋白和其不同结构域、dndD以及dndE基因进行克隆构建 | 第138-140页 |
| ·DndB蛋白各保守区，DndD以及DndE基因在pET-446上的蛋白诱导表达情况 | 第140-142页 |
| ·纯化带有His-Tag标签的Dnd系列蛋白的结果 | 第142-143页 |
| ·讨论 | 第143-146页 |
| 第九章 DNA磷硫酰化的生物学意义初探 | 第146-156页 |
| ·前言 | 第146-147页 |
| ·结果和分析 | 第147-154页 |
| ·野生型和突变株的生物生长量(Biomass)的测定 | 第147-149页 |
| ·野生型和突变株喂养不同的物质的生长状况 | 第149-151页 |
| ·野生型和突变株对抗生素耐受性测试 | 第151-152页 |
| ·dndA基因的多效生理表型 | 第152-154页 |
| ·讨论 | 第154-156页 |
| 第十章 总结和展望 | 第156-162页 |
| ·本研究工作总结 | 第156-158页 |
| ·本研究工作展望 | 第158-162页 |
| 参考文献 | 第162-170页 |
| 致谢 | 第170-172页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 | 第172页 |
