| 中文摘要 | 第1-9页 |
| Abstract | 第9-11页 |
| 第一章 文献综述 | 第11-27页 |
| 1 纤维素生物合成研究进展 | 第11-13页 |
| ·纤维素的结构及其作用 | 第11-12页 |
| ·纤维素体外合成的研究概况 | 第12页 |
| ·植物纤维素生物合成途径研究进展 | 第12-13页 |
| 2 植物纤维素合成酶基因研究进展 | 第13-24页 |
| ·植物纤维素合成酶基因的发现 | 第13-15页 |
| ·植物纤维素合成酶的基因结构 | 第15-16页 |
| ·纤维素合成酶的超家族和纤维素合成酶相似蛋白 | 第16-19页 |
| ·CesA与Csl蛋白的超家族 | 第18-19页 |
| ·植物纤维素合成酶的时空表达规律 | 第19-20页 |
| ·纤维素的生物合成是多个纤维素合成酶基因协同作用的结果 | 第20-23页 |
| ·参与纤维素生物合成的其它基因 | 第23-24页 |
| 3 问题与展望 | 第24-25页 |
| 4 本研究拟解决的问题 | 第25-27页 |
| 第二章 苎麻纤维素合成酶基因BnCesA1的克隆及序列分析 | 第27-58页 |
| 1 材料与试剂 | 第27-28页 |
| ·植物材料 | 第27页 |
| ·菌株 | 第27页 |
| ·酶与试剂盒 | 第27页 |
| ·试剂 | 第27-28页 |
| 2 实验方法 | 第28-40页 |
| ·苎麻RNA的提取及RNA质量检测 | 第28-29页 |
| ·植物RNA的抽提 | 第28页 |
| ·检测所抽提的RNA质量 | 第28-29页 |
| ·RNA电泳点样 | 第29页 |
| ·测定所抽提RNA的OD_(260)及OD_(260)／OD_(280)值 | 第29页 |
| ·用RT-PCR的方法获得苎麻纤维素合成酶基因中间保守片段 | 第29-34页 |
| ·简并引物的设计 | 第29页 |
| ·苎麻cDNA第一链的合成 | 第29-30页 |
| ·苎麻BnCesA1基因中间保守片段的PCR扩增 | 第30-31页 |
| ·简并引物最佳退火的确定 | 第30-31页 |
| ·PCR反应最佳Mg~(2+)浓度的确定 | 第31页 |
| ·BnCesA1基因中间保守片段的PCR扩增 | 第31页 |
| ·切胶回收目的基因片段 | 第31-32页 |
| ·将回收的目的基因片段克隆到pMD18-T Vector上 | 第32页 |
| ·大肠杆菌CaCl_2法制备及转化感受态细胞 | 第32页 |
| ·目的基因的鉴定及测序 | 第32-34页 |
| ·菌落PCR鉴定 | 第32-33页 |
| ·质粒双酶切鉴定 | 第33-34页 |
| ·5′RACE获得5′端目的基因 | 第34-38页 |
| ·5′RACE法原理示意图 | 第34页 |
| ·引物设计及PCR扩增 | 第34-38页 |
| ·引物设计 | 第34-35页 |
| ·苎麻mRNA的分离 | 第35-36页 |
| ·苎麻cDNA第一链的合成 | 第36页 |
| ·Hybrid RNA的分解 | 第36-37页 |
| ·单链cDNA环化 | 第37页 |
| ·第一轮反向PCR扩增反应 | 第37页 |
| ·第二轮反向PCR扩增反应 | 第37-38页 |
| ·3′RACE获得3′端目的基因 | 第38-40页 |
| ·3′RACE原理图 | 第38页 |
| ·引物设计及PCR扩增 | 第38-40页 |
| ·引物设计 | 第38页 |
| ·苎麻cDNA第一链的合成及目的片段扩增 | 第38-40页 |
| ·苎麻纤维素合成酶基因(BnCesA1)序列的生物信息学分析 | 第40页 |
| 3 结果与分析 | 第40-55页 |
| ·苎麻总RNA提取 | 第40页 |
| ·BnCesA1基因中间片段的克隆 | 第40-42页 |
| ·BnCesA1基因3′端序列的克隆 | 第42页 |
| ·BnCesA1基因5′端序列的克隆 | 第42-44页 |
| ·BnCesA1基因序列拼接及生物信息学分析 | 第44-55页 |
| ·核苷酸序列分析 | 第44-47页 |
| ·氨基酸序列分析 | 第47-53页 |
| ·BnCesA1基因编码蛋白质结构特征分析 | 第53-55页 |
| ·功能性模体的搜索 | 第53-54页 |
| ·跨膜区的预测 | 第54-55页 |
| ·保守结构域的预测 | 第55页 |
| 4 讨论 | 第55-58页 |
| ·关于RACE技术 | 第55-56页 |
| ·对于TAKARA公司5′RACE技术的探讨 | 第56-58页 |
| 第三章 BnCesA1基因组织表达情况的研究 | 第58-71页 |
| 1 材料与试剂 | 第58页 |
| ·酶与试剂 | 第58页 |
| 2 实验方法 | 第58-62页 |
| ·不同组织总RNA的提取 | 第58-59页 |
| ·苎麻cDNA第一链的合成 | 第59页 |
| ·半定量RT-PCR表达分析引物设计 | 第59页 |
| ·表达分析PCR扩增反应条件优化 | 第59-61页 |
| ·EX1-2引物最佳退火温度的优化 | 第59-60页 |
| ·PCR扩增反应Mg~(2+)浓度优化 | 第60页 |
| ·PCR反应循环数的确定 | 第60页 |
| ·内参18S rRNA基因扩增 | 第60-61页 |
| ·18S rRNA基因扩增反应Mg~(2+)浓度优化 | 第61页 |
| ·不同组织BnCesA1基因的扩增 | 第61-62页 |
| ·数据分析 | 第62页 |
| 3 结果与分析 | 第62-68页 |
| ·不同组织RNA提取结果 | 第62页 |
| ·PCR扩增体系的优化 | 第62页 |
| ·EX1、EX2引物反应条件优化结果 | 第62-68页 |
| ·Mg~(2+)浓度优化 | 第62-63页 |
| ·EX1-2引物退火温度优化 | 第63页 |
| ·内参18S rRNA基因扩增条件优化 | 第63-64页 |
| ·Mg~(2+)梯度优化 | 第63-64页 |
| ·循环数对平台期的影响 | 第64-66页 |
| ·对苎麻BnCesA1基因在不同组织表达定量的结果 | 第66-68页 |
| 4 讨论 | 第68-71页 |
| ·关于半定量RT-PCR | 第68-69页 |
| ·关于BnCesA1基因的表达 | 第69-71页 |
| 第四章 BnCesA1基因核心区段反义表达载体的构建及对烟草的转化 | 第71-91页 |
| 1 材料与试剂 | 第71-72页 |
| ·菌株与质粒 | 第71页 |
| ·植物材料及培养基 | 第71-72页 |
| ·酶与试剂盒 | 第72页 |
| ·试剂 | 第72页 |
| 2 实验方法 | 第72-78页 |
| ·引物设计及反义片段的PCR扩增 | 第72-73页 |
| ·引物设计 | 第72页 |
| ·目的基因BnCesA的扩增 | 第72-73页 |
| ·反义植物表达载体pWM-BnCesA的构建及检测 | 第73-74页 |
| ·反义表达载体pWM-BnCesA的构建 | 第73-74页 |
| ·反义表达载体pWM-BnCesA的菌落PCR及酶切检测 | 第74页 |
| ·反义表达载体pWM-BnCesA转化根癌农杆菌 | 第74-75页 |
| ·农杆菌感受态细胞的制备和转化 | 第75页 |
| ·叶盘法转化烟草 | 第75-76页 |
| ·农杆菌的培养 | 第75-76页 |
| ·共培养 | 第76页 |
| ·诱导丛生芽 | 第76页 |
| ·诱导生根 | 第76页 |
| ·再生植株的移栽 | 第76页 |
| ·转基因烟草的PCR检测 | 第76-78页 |
| ·CTAB法抽提植物总DNA | 第76-77页 |
| ·转基因烟草的PCR检测 | 第77-78页 |
| ·标记基因Hyg~r的PCR检测 | 第77-78页 |
| ·目的基因BnCesA1的检测 | 第78页 |
| ·转基因烟草组织切片检测 | 第78页 |
| ·转基因烟草表型观察 | 第78页 |
| 3 结果与分析 | 第78-87页 |
| ·反义植物表达载体pWM-BnCes的构建流程 | 第78-79页 |
| ·BnCesA1基因反义片段与pWM101载体的双酶切结果 | 第79-80页 |
| ·反义表达载体pWM-BnCesA的菌落PCR和酶切检测 | 第80-81页 |
| ·反义表达载体pWM-BnCesA转化农杆菌LBA4404的检测 | 第81页 |
| ·叶盘法转化烟草 | 第81-84页 |
| ·共培养 | 第81-82页 |
| ·诱导丛生芽 | 第82-83页 |
| ·诱导生根 | 第83页 |
| ·移栽 | 第83-84页 |
| ·反义转基因烟草的PCR检测 | 第84-85页 |
| ·转基因烟草茎部组织切片观察 | 第85-86页 |
| ·转基因烟草表型观察 | 第86-87页 |
| 4 讨论 | 第87-91页 |
| ·反义RNA技术的基本原理 | 第87-88页 |
| ·反义RNA技术的基本原理 | 第87页 |
| ·反义RNA靶序列的确定 | 第87-88页 |
| ·反义表达载体的构建 | 第88页 |
| ·叶盘法转化烟草 | 第88-91页 |
| ·共培养 | 第88-89页 |
| ·诱导丛生芽 | 第89页 |
| ·诱导生根 | 第89页 |
| ·移栽 | 第89-91页 |
| 第五章 结论 | 第91-92页 |
| 参考文献 | 第92-97页 |
| 附录A.BnCesA1基因中间片段测序报告 | 第97-101页 |
| 附录B.BnCesA1基因3′RACE测序报告 | 第101-104页 |
| 附录C.BnCesA1基因5′RACE测序报告 | 第104-105页 |
| 附录D.BnCesA1基因登陆GenBank | 第105-107页 |
| 附录E.转基因烟草反义片段测序报告 | 第107-108页 |
| 附录F.缩略词表 | 第108-109页 |
| 附录G.主要试剂配置 | 第109-111页 |
| 附录H.载体图谱 | 第111-112页 |
| 致谢 | 第112-113页 |
| 作者简介 | 第113页 |
