| 英文缩略词表 | 第1-11页 |
| 主要仪器设备 | 第11-12页 |
| 中文摘要 | 第12-14页 |
| 英文摘要 | 第14-16页 |
| 前言 | 第16-21页 |
| 第一章 志贺氏菌ipaC基因的克隆及双杂交诱饵蛋白载体的构建 | 第21-40页 |
| 一、实验材料 | 第22-23页 |
| 1、菌株 | 第22页 |
| 2、质粒和载体 | 第22页 |
| 3、工具酶及试剂盒 | 第22页 |
| ·限制性内切酶 | 第22页 |
| ·工具酶 | 第22页 |
| ·试剂盒 | 第22页 |
| 4、主要试剂 | 第22-23页 |
| 二、实验方法 | 第23-30页 |
| 1、试剂配制 | 第23-25页 |
| ·酵母双杂交相关试剂 | 第23页 |
| ·Western-blot相关试剂 | 第23-24页 |
| ·酵母蛋白提取相关试剂 | 第24-25页 |
| 2、目的基因片段克隆 | 第25-27页 |
| ·痢疾菌的培养 | 第25页 |
| ·引物设计 | 第25页 |
| ·PCR扩增 | 第25-26页 |
| ·PCR产物的琼脂糖凝胶电泳回收 | 第26页 |
| ·诱饵质粒PCR产物的分子克隆 | 第26页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 | 第26-27页 |
| ·快速质粒制备 | 第27页 |
| ·重组子的筛选与鉴定 | 第27页 |
| 3、诱饵蛋白质粒pGBKT7-ipaC的构建及鉴定 | 第27页 |
| 4、诱饵蛋白质粒转化酵母细胞 | 第27-28页 |
| ·酵母感受态的制备 | 第27-28页 |
| ·酵母小规模转化 | 第28页 |
| 5、β-半乳糖苷酶显色反应分析 | 第28页 |
| 6、酵母双杂交系统正确性检验 | 第28-29页 |
| 7、酵母的长期保存与复苏 | 第29页 |
| 8、诱饵蛋白的表达检测(尿素／SDS法) | 第29-30页 |
| ·酵母细胞蛋白样品的制备 | 第29页 |
| ·SDS-PAGE凝胶电泳 | 第29-30页 |
| ·转膜 | 第30页 |
| ·Western—blotting | 第30页 |
| 三、实验结果 | 第30-36页 |
| 1、ipaC目的基因片段的PCR扩增 | 第30-31页 |
| 2、测序质粒pMDT-ipaC的构建及鉴定 | 第31-33页 |
| 3、诱饵蛋白pGBKT7-ipaC的构建及鉴定 | 第33-34页 |
| 4、酵母双杂交系统的验证 | 第34-35页 |
| 5、诱饵蛋白质粒pGBKT7-ipaC转录活性分析 | 第35页 |
| 6、诱饵蛋白质粒pGBKT7-ipaC的蛋白表达分析 | 第35-36页 |
| 四、讨论 | 第36-40页 |
| 第二章 与Ipac相互作用蛋白的筛选 | 第40-64页 |
| 一、实验材料 | 第41-42页 |
| 1、菌株 | 第41页 |
| 2、质粒与文库 | 第41页 |
| 3、测序引物 | 第41页 |
| 4、工具酶及试剂盒 | 第41页 |
| ·限制性内切酶 | 第41页 |
| ·试剂盒 | 第41页 |
| 5、主要试剂 | 第41-42页 |
| 二、实验方法 | 第42-47页 |
| 1、试剂配制 | 第42页 |
| 2、常规的分子克隆操作 | 第42页 |
| 3、酵母感受态的制备 | 第42页 |
| 4、转化酵母 | 第42页 |
| 5、转化效率与筛选克隆数的计算 | 第42页 |
| 6、文库的滴定 | 第42-43页 |
| 7、文库的放大和质粒制备 | 第43页 |
| 8、cDNA文库的筛选 | 第43-44页 |
| 9、酵母质粒提取 | 第44页 |
| 10、电转化大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第44-45页 |
| 11、酵母质粒的转化 | 第45页 |
| 12、阳性AD质粒的筛选鉴定 | 第45页 |
| 13、pGBKT7-ipaC与侯选蛋白在酵母中相互作用的确证方法 | 第45页 |
| 14、核酸序列分析和同源性分析 | 第45-47页 |
| 三、实验结果 | 第47-59页 |
| 1、库容量的滴定 | 第47页 |
| 2、转化效率的计算 | 第47页 |
| 3、文库杂交结果 | 第47页 |
| 4、核酸序列分析和同源性检索 | 第47-58页 |
| ·1~#蛋白(GDBR1) | 第47-50页 |
| ·2~#蛋白泛素素1(UBQLN1) | 第50-52页 |
| ·3~#蛋白泛素素2(UBQLN2) | 第52-54页 |
| ·4~#蛋白A1U(ataxin-1ubiquitin-likeinteractingprotein) | 第54-56页 |
| ·5~#蛋白RanBPM | 第56-58页 |
| 5、pGBKT7-ipaC与5个侯选蛋白在酵母中相互作用的再次验证 | 第58-59页 |
| 四、讨论 | 第59-64页 |
| 第三章 泛素结构域与IpaC作用功能结构域的鉴定 | 第64-76页 |
| 一、实验材料 | 第64-65页 |
| 1、菌株 | 第64-65页 |
| 2、质粒和载体 | 第65页 |
| 3、工具酶及试剂盒 | 第65页 |
| ·限制性内切酶 | 第65页 |
| ·工具酶 | 第65页 |
| ·试剂盒 | 第65页 |
| 4、主要试剂 | 第65页 |
| 二、实验方法 | 第65-68页 |
| 1、试剂配制 | 第65页 |
| 2、IpaC结构域质粒pGBKT7-ipaC~(Ⅰ～Ⅴ)的构建和鉴定 | 第65-67页 |
| ·引物设计 | 第65-66页 |
| ·PCR扩增 | 第66页 |
| ·PCR产物的琼脂糖凝胶电泳回收 | 第66-67页 |
| ·目的片断的连接 | 第67页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 | 第67页 |
| ·快速质粒制备 | 第67页 |
| ·重组子的筛选与鉴定 | 第67页 |
| 3、IpaC不同结构域诱饵蛋白与pGADT-GDBR1相互作用的鉴定 | 第67页 |
| ·酵母感受态的制备 | 第67页 |
| ·酵母小规模转化 | 第67页 |
| ·β-半乳糖苷酶显色反应分析 | 第67页 |
| 4、IpaC跨膜结构域与GDBR1泛素样结构域相互作用的鉴定 | 第67-68页 |
| ·GDBR1泛素样结构域的克隆 | 第67-68页 |
| ·IpaC跨膜结构域与GDBRI泛素样结构域相互作用的鉴定 | 第68页 |
| 三、实验结果 | 第68-71页 |
| 1、IpaC不同结构域基因片段的PCR扩增 | 第68-69页 |
| 2、IpaC不同结构域诱饵蛋白表达载体的构建及鉴定 | 第69页 |
| 3、β-半乳糖苷酶显色反应分析 | 第69-70页 |
| 4、IpaC跨膜结构域与GDBR1泛素样结构域相互作用的鉴定 | 第70-71页 |
| 四、讨论 | 第71-76页 |
| 总结 | 第76-78页 |
| 参考文献 | 第78-84页 |
| 致谢 | 第84-85页 |
| 硕士期间发表文章目录 | 第85页 |
