| 致谢 | 第1-5页 |
| 中文摘要 | 第5-11页 |
| 第一章 霍乱毒素B亚单位的研究进展 | 第11-20页 |
| 1 霍乱弧菌(V. cholerae)和霍乱毒素 | 第11-13页 |
| ·霍乱弧菌 | 第11页 |
| ·霍乱毒素 | 第11-13页 |
| 2 霍乱毒素B亚单位的基因表达 | 第13-14页 |
| 3 霍乱毒素B亚单位的应用 | 第14-16页 |
| ·载体蛋白 | 第14页 |
| ·免疫佐剂 | 第14页 |
| ·口服及鼻内免疫蛋白 | 第14-15页 |
| ·霍乱毒素B亚单位与免疫原的不同使用方法和不同的免疫途径对其免疫佐剂作用的影响 | 第15-16页 |
| 4 霍乱毒素B亚单位的研究进展 | 第16-20页 |
| ·融合表达研究 | 第16-17页 |
| ·口服免疫研究 | 第17-18页 |
| ·鼻内免疫研究 | 第18-20页 |
| 第二章 家蚕／BmNPV表达系统的研究进展 | 第20-32页 |
| 1 家蚕／BmNPV表达系统的原理 | 第20-22页 |
| 2 转移载体 | 第22-23页 |
| ·转移载体的启动子 | 第22-23页 |
| ·蛋白融合表达的转移载体 | 第23页 |
| ·多元转移载体 | 第23页 |
| 3 重组病毒筛选方法的改进 | 第23-27页 |
| ·NPV DNA线性化并删除ORF1629法 | 第24-25页 |
| ·应用YAC操作杆状病毒基因组 | 第25-26页 |
| ·E. coli Bacmid系统 | 第26页 |
| ·体外定点重组 | 第26页 |
| ·neo~r筛选 | 第26页 |
| ·条件致死性筛选 | 第26-27页 |
| ·产生多角体的重组病毒 | 第27页 |
| 4 家蚕／BmNPV表达系统表达量问题 | 第27-29页 |
| ·影响外源基因表达量的因素 | 第27-28页 |
| ·外源基因及其编码产物性质 | 第27-28页 |
| ·启动子的特性 | 第28页 |
| ·转移载体 | 第28页 |
| ·表达宿主 | 第28页 |
| ·外源基因表达量提高的研究 | 第28-29页 |
| ·融合蛋白与表达量 | 第28-29页 |
| ·半胱氨酸蛋白酶(CP)基因与表达量 | 第29页 |
| ·表达宿主等环境条件与表达量 | 第29页 |
| 5 家蚕／BmNPV表达系统的特点 | 第29-31页 |
| 6 家蚕／BmNPV表达载体系统的发展前景 | 第31-32页 |
| 第三章 实验设计方案 | 第32-35页 |
| 1 本实验的目的和意义 | 第32页 |
| 2 本研究的主要内容 | 第32-33页 |
| 3 本研究所要解决的关键性问题 | 第33页 |
| 4 实验流程图 | 第33-35页 |
| 第四章 家蚕杆状病毒重组转移载体的构建 | 第35-47页 |
| ·材料和试剂 | 第35-37页 |
| ·实验方法 | 第37-43页 |
| ·以质粒pBlue-CTB为模板PCR扩增目的片段 | 第37-38页 |
| ·低熔点胶回收目的片段 | 第38-39页 |
| ·重组转移载体pBacPAK8-CTB的制备 | 第39-40页 |
| ·目的基因PCR产物的低熔点胶回收片段与载体pBacPAK8的双酶切 | 第39页 |
| ·低熔点胶电泳回收目的片段并进行产物纯化 | 第39页 |
| ·pBacPAK8与目的基因的连接反应 | 第39-40页 |
| ·E. coli TG1感受态细胞的制备 | 第40页 |
| ·连接产物转化感受态细胞 | 第40页 |
| ·碱法小批量抽提质粒DNA | 第40-41页 |
| ·重组转移载体的鉴定 | 第41-42页 |
| ·双酶切鉴定 | 第41页 |
| ·单酶切鉴定 | 第41-42页 |
| ·pBacPAK8-CTB的PCR鉴定 | 第42页 |
| ·基因序列测序 | 第42页 |
| ·质粒DNA的抽提和纯化 | 第42页 |
| ·核酸电泳 | 第42-43页 |
| ·结果和分析 | 第43-47页 |
| ·CTB基因的序列测定 | 第43页 |
| ·重组转移载体pBacPAK8-CTB的构建 | 第43-45页 |
| ·转移载体pBacPAK8的图谱 | 第43-44页 |
| ·重组转移载体的构建策略 | 第44-45页 |
| ·重组转移载体pBacPAK-CTB的鉴定 | 第45-47页 |
| 第五章 重组家蚕杆状病毒的筛选和鉴定 | 第47-60页 |
| ·材料和试剂 | 第47-49页 |
| ·实验方法 | 第49-60页 |
| ·细胞培养、冻存与复苏 | 第49页 |
| ·病毒培养 | 第49页 |
| ·病毒滴度测定 | 第49页 |
| ·Bm-BacPAK6 DNA的提取及酶切线性化 | 第49-50页 |
| ·重组转移转移质粒与线性化病毒DNA共转染 | 第50-51页 |
| ·重组病毒的筛选 | 第51页 |
| ·重组病毒的DNA Southern杂交鉴定 | 第51-60页 |
| 第六章 霍乱毒素B亚基在家蚕细胞、幼虫和蚕蛹中的表达 | 第60-70页 |
| ·材料和试剂 | 第60-62页 |
| ·实验方法 | 第62-64页 |
| ·重组病毒在家蚕细胞、五龄幼虫和蚕蛹中的表达 | 第62页 |
| ·SDS-PAGE电泳分析 | 第62-63页 |
| ·表达产物的ELISA检测 | 第63页 |
| ·表达产物的Western blotting分析 | 第63-64页 |
| ·结果分析 | 第64-70页 |
| ·BmN细胞内表达产物的ELISA检测 | 第64-65页 |
| ·ELISA法检测其表达时相变化 | 第65-67页 |
| ·CTB在家蚕幼虫中表达的时相变化 | 第65-66页 |
| ·CTB在蚕蛹和细胞中表达的时相变化 | 第66-67页 |
| ·表达产物的SDS-PAGE电泳 | 第67-68页 |
| ·细胞表达产物的蛋白质电泳与Western blotting分析 | 第68-70页 |
| 第七章 霍乱毒素B亚单位(CTB)和多角体的融合表达及其与CTB在家蚕细胞和幼虫里的表达量比较 | 第70-75页 |
| ·材料和试剂 | 第70页 |
| ·实验方法 | 第70-72页 |
| ·家蚕杆状病毒重组转移载体的构建 | 第70页 |
| ·以质粒pBacPAK-CTB为模板PCR扩增目的片段 | 第70页 |
| ·克隆操作的其余步骤与所构建载体的鉴定步骤同前面各章 | 第70页 |
| ·重组家蚕杆状病毒的筛选、鉴定与表达步骤同前面各章 | 第70页 |
| ·ELISA法对表达产物(CTB和4aa-CTB)的定量检测 | 第70-71页 |
| ·标准品HspA-CTB的包被 | 第71页 |
| ·检测样本的包被 | 第71页 |
| ·ELISA法检测表达产物(CTB和4aa-CTB)与CTB抗体的反应 | 第71-72页 |
| ·结果分析 | 第72-74页 |
| ·质粒pBacPAK-4aa-CTB的测序结果 | 第72页 |
| ·CTB和4aa-CTB与CTB抗体的反应比较 | 第72-73页 |
| ·CTB和4aa-CTB的表达量比较 | 第73-74页 |
| ·讨论 | 第74-75页 |
| 总结 | 第75-77页 |
| Abstract | 第77-79页 |
| 参考文献 | 第79-86页 |
| 附录 | 第86-88页 |
| 攻读硕士学位期间发表论文目录 | 第86-88页 |
