| 中文摘要 | 第1-8页 |
| Abstract | 第8-15页 |
| 引言 | 第15-17页 |
| 第一章 朊蛋白和可传播海绵状脑病概述 | 第17-46页 |
| 引言 | 第17-18页 |
| 1. 朊病毒的研究史 | 第18-20页 |
| 2. "唯蛋白"假说及PrP~(Sc)的纯化与鉴定 | 第20-24页 |
| ·"唯蛋白"假说 | 第20-21页 |
| ·PrP是朊病毒的主要组分 | 第21-22页 |
| ·朊病毒的特性 | 第22-23页 |
| ·PrP~(Sc)是朊病毒感染因子 | 第23页 |
| ·"唯蛋白"假说的争论 | 第23-24页 |
| 3. 朊蛋白的结构 | 第24-27页 |
| ·朊蛋白的一级结构 | 第25-26页 |
| ·朊蛋白的高级结构 | 第26-27页 |
| 4. 正常细胞型朊蛋白的生理功能 | 第27-30页 |
| ·PrP~C是Cu~(2+)受体并具有抗氧化功能 | 第27-28页 |
| ·PrP~C抗叠朊的神经毒性 | 第28页 |
| ·维持正常神经系统功能和参与介导神经元分化 | 第28-29页 |
| ·PrP~C参与信号转导以及记忆的形成 | 第29-30页 |
| ·PrP~C参与铜离子代谢和介导细胞内吞 | 第30页 |
| 5. 可传播性海绵状脑病(TSEs) | 第30-35页 |
| ·遗传型朊病毒病 | 第31-33页 |
| ·感染型朊病毒病 | 第33-34页 |
| ·散发型克雅氏病 | 第34-35页 |
| 6. 朊病毒致病的分子机制 | 第35-40页 |
| ·朊蛋白的构象转变 | 第35-37页 |
| ·朊蛋白的聚集 | 第37-39页 |
| ·PrPS~(Sc)的复制和增殖 | 第39页 |
| ·PrP~(Sc)的神经细胞毒性 | 第39-40页 |
| ·PrP~C和PrP~(Sc)分子学特性比较 | 第40页 |
| 7. 朊病毒疾病的诊断 | 第40-44页 |
| ·病毒病的临床和组织病理诊断 | 第41页 |
| ·生物学诊断(Bioassay) | 第41页 |
| ·免疫学诊断 | 第41-42页 |
| ·基因诊断 | 第42-43页 |
| ·其他诊断方法 | 第43页 |
| ·朊病毒病的防治 | 第43-44页 |
| 8. 朊病毒疾病的现状与展望 | 第44-46页 |
| 第二章 朊蛋白与二价离子的相互作用 | 第46-55页 |
| 引言 | 第46页 |
| 1. 朊蛋白与铜离子相互作用的证据 | 第46-48页 |
| 2. 铜离子与细胞朊蛋白的结合及其生理功能 | 第48-49页 |
| 3. 二价阳离子在朊病毒病发病机理中扮演的角色 | 第49-51页 |
| 4. 假说 | 第51-55页 |
| 第三章 铜离子促进PrP形成具神经细胞毒性的可溶性寡聚体 | 第55-90页 |
| 1. 前言 | 第55页 |
| 2. 实验材料与方法 | 第55-74页 |
| ·材料与试剂 | 第55-62页 |
| ·质粒、菌株、基本培养基 | 第56页 |
| ·PCR | 第56-57页 |
| ·质粒小量提取 | 第57页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳 | 第57页 |
| ·DNA回收 | 第57页 |
| ·外源片段的连接 | 第57页 |
| ·酶切反应 | 第57-58页 |
| ·蛋白质提取与纯化用试剂 | 第58页 |
| ·蛋白质超滤浓缩 | 第58页 |
| ·SDS—PAGE电泳 | 第58-59页 |
| ·人PrP多克隆抗体制备 | 第59-60页 |
| ·Western blot | 第60页 |
| ·细胞培养 | 第60-61页 |
| ·实验仪器 | 第61-62页 |
| ·实验方法 | 第62-74页 |
| ·设计引物 | 第62-63页 |
| ·PCR | 第63页 |
| ·PCR产物回收 | 第63-64页 |
| ·T载体连接、转化、扩增 | 第64页 |
| ·质粒提取 | 第64-65页 |
| ·酶切鉴定 | 第65页 |
| ·测序 | 第65页 |
| ·与表达载体连接、转化、扩增 | 第65-66页 |
| ·蛋白质的表达 | 第66页 |
| ·SDS-PAGE电泳 | 第66-67页 |
| ·PrP的初纯化 | 第67-68页 |
| ·PrP蛋白质的再纯化与复性 | 第68页 |
| ·蛋白质浓缩与定量 | 第68-69页 |
| ·PrP多克隆抗体制备 | 第69-70页 |
| ·Western Blot | 第70-71页 |
| ·普通细胞传代培养、冻存与复苏 | 第71-72页 |
| ·PrP和铜离子的孵育 | 第72页 |
| ·圆二色谱测定 | 第72-73页 |
| ·外源荧光ANS测定 | 第73页 |
| ·分子筛分离可溶性寡聚体 | 第73页 |
| ·原子力显微镜观察寡聚体 | 第73-74页 |
| ·流式细胞术 | 第74页 |
| 3. 实验结果 | 第74-86页 |
| ·PCR扩增PrP(90-231)基因片段及表达载体构建 | 第74-75页 |
| ·PrP(90-231)蛋白表达与纯化 | 第75-77页 |
| ·蛋白预表达 | 第75-76页 |
| ·蛋白质的柱上复性与纯化 | 第76-77页 |
| ·圆二色谱检测pH5.0条件下PrP二级结构转变 | 第77-78页 |
| ·外源荧光bis-ANS检测 | 第78-79页 |
| ·聚丙烯酰胺凝胶电泳检测pH5.0溶液中PrP的聚集 | 第79-80页 |
| ·分子筛分离可溶性PrP寡聚体 | 第80-81页 |
| ·原子力显微镜观察寡聚体形态 | 第81-82页 |
| ·MTT实验检测寡聚体对细胞的毒性作用 | 第82-84页 |
| ·PrP寡聚体引起细胞凋亡 | 第84-85页 |
| ·荧光共聚焦显微镜观察寡聚体对细胞的影响 | 第85-86页 |
| 4. 讨论 | 第86-90页 |
| 第四章 铜离子促进PrP形成不可溶聚集 | 第90-101页 |
| 1. 前言 | 第90-91页 |
| 2. 实验材料与方法 | 第91-94页 |
| ·实验材料与试剂 | 第91-93页 |
| ·PrP聚集反应缓冲液 | 第91页 |
| ·细胞培养 | 第91-92页 |
| ·实验仪器 | 第92-93页 |
| ·实验方法 | 第93-94页 |
| ·朊蛋白PrP(90-231)的表达与纯化(同第三章2.1.8-2.1.9) | 第93页 |
| ·PrP聚集 | 第93页 |
| ·圆二色光谱测定 | 第93页 |
| ·ANS外源荧光测定 | 第93页 |
| ·静态光散射测PrP聚集 | 第93页 |
| ·MTT法检测细胞存活率 | 第93-94页 |
| 3. 实验结果 | 第94-99页 |
| ·圆二色谱检测PrP二级结构转变 | 第94-95页 |
| ·Bis-ANS检测PrP疏水结构变化 | 第95-96页 |
| ·PrP的聚集 | 第96-98页 |
| ·PrP聚集体的细胞毒性 | 第98-99页 |
| 4. 讨论 | 第99-101页 |
| 第五章 铜离子抑制PrP聚集形成淀粉样纤维 | 第101-110页 |
| 1. 前言 | 第101页 |
| 2. 实验材料与方法 | 第101-104页 |
| ·实验材料与试剂 | 第101-103页 |
| ·朊蛋白PrP(90-231)的表达与纯化(同第三章2.1.8-2.1.9) | 第101-102页 |
| ·PrP聚集反应缓冲液 | 第102页 |
| ·外源荧光染料Thioflavin T (ThT) | 第102页 |
| ·实验仪器 | 第102-103页 |
| ·实验方法 | 第103-104页 |
| ·PrP和铜离子的孵育 | 第103页 |
| ·静态光散射法测定PrP(90-231)聚集 | 第103页 |
| ·外源荧光Thioflavin T(ThT)测定 | 第103-104页 |
| ·原子力显微镜观察PrP纤维的形成 | 第104页 |
| 3. 实验结果 | 第104-107页 |
| ·静态光散射实验测PrP(90-231)的聚集 | 第104-105页 |
| ·外源荧光染料Thioflavin T(ThT)检测PrP淀粉样纤维的聚集 | 第105-107页 |
| ·原子力显微镜观察PrP聚集情况 | 第107页 |
| 4. 讨论 | 第107-110页 |
| 研究总结 | 第110-112页 |
| 参考文献 | 第112-128页 |
| 博士期间发表的论文 | 第128-129页 |
| 致谢 | 第129页 |
