| 摘要 | 第4-5页 |
| Abstract | 第5页 |
| 英文缩写词 | 第6-11页 |
| 第1章 绪论 | 第11-19页 |
| 1.1 HER2阳性乳腺癌情况简介 | 第11-12页 |
| 1.1.1 HER2简介 | 第11页 |
| 1.1.2 乳腺癌发病情况简介 | 第11-12页 |
| 1.1.3 HER2阳性乳腺癌的治疗 | 第12页 |
| 1.2 自然杀伤细胞简介 | 第12-13页 |
| 1.3 嵌合抗原受体简介 | 第13-15页 |
| 1.3.1 嵌合抗原受体的基本结构 | 第13页 |
| 1.3.2 嵌合抗原受体胞外结构域的发展 | 第13页 |
| 1.3.3 嵌合抗原受体跨膜区和胞内信号转导域的发展 | 第13-14页 |
| 1.3.4 CAR-T细胞研究进展 | 第14页 |
| 1.3.5 CAR-NK细胞研究进展 | 第14-15页 |
| 1.4 亲合体简介 | 第15-17页 |
| 1.4.1 亲合体简介 | 第15-16页 |
| 1.4.2 亲合体的应用 | 第16-17页 |
| 1.5 本文的研究内容及意义 | 第17-19页 |
| 第2章 3种anti-HER2CAR重组质粒的构建 | 第19-35页 |
| 2.1 实验材料和试剂 | 第19-20页 |
| 2.1.1 质粒与感受态细胞 | 第19页 |
| 2.1.2 工具酶及其缓冲液 | 第19页 |
| 2.1.3 实验试剂 | 第19页 |
| 2.1.4 主要溶液配制 | 第19-20页 |
| 2.2 实验仪器 | 第20-21页 |
| 2.3 ZHER2-28ζ-pLVX-Puro的构建 | 第21-26页 |
| 2.3.1 CAR结构胞外区ZHER2的设计 | 第21页 |
| 2.3.2 ZHER2-pUC57质粒的扩增与酶切 | 第21-22页 |
| 2.3.3 CD28-CD3ζ的PCR及纯化 | 第22-23页 |
| 2.3.4 CD28-CD3ζPCR产物的酶切与胶回收 | 第23页 |
| 2.3.5 pLVX-Puro载体的酶切与胶回收 | 第23页 |
| 2.3.6 CD28-CD3ζ片段与pLVX-Puro载体的连接 | 第23-24页 |
| 2.3.7 28 ζ-pLVX-Puro质粒的转化 | 第24页 |
| 2.3.8 28 ζ-pLVX-Puro重组质粒的筛选与鉴定 | 第24-25页 |
| 2.3.9 2 种ZHER2与28ζ-pLVX-Puro重组质粒的连接 | 第25页 |
| 2.3.10 ZHER2-28ζ-pLVX-Puro重组质粒的转化 | 第25页 |
| 2.3.11 重组质粒的筛选与鉴定 | 第25-26页 |
| 2.4 anti-HER2scFv-28ζ-IRES-mCherry-pLVX-Puro的构建 | 第26-29页 |
| 2.4.1 anti-HER2scFv-28ζ-IRES-mCherry质粒的设计 | 第26页 |
| 2.4.2 目的基因和慢病毒载体的酶切 | 第26-27页 |
| 2.4.3 胶回收 | 第27页 |
| 2.4.4 连接 | 第27-28页 |
| 2.4.5 质粒转化 | 第28页 |
| 2.4.6 重组质粒的筛选与鉴定 | 第28-29页 |
| 2.5 实验结果与讨论 | 第29-33页 |
| 2.5.1 ZHER2-28ζ-pLVX-Puro重组质粒的构建 | 第29-31页 |
| 2.5.2 scFv-28ζ-IRESmCherry-pLVX-Puro重组质粒的构建 | 第31-32页 |
| 2.5.3 插入序列长短与构建难度的关系 | 第32-33页 |
| 2.6 本章小结 | 第33-35页 |
| 第3章 3种anti-HER2CAR的表达及鉴定 | 第35-49页 |
| 3.1 实验材料和试剂 | 第35-36页 |
| 3.1.1 细胞与实验试剂 | 第35页 |
| 3.1.2 主要溶液配制 | 第35-36页 |
| 3.2 实验仪器 | 第36-37页 |
| 3.3 实验方法 | 第37-43页 |
| 3.3.1 293 TX细胞的复苏 | 第37页 |
| 3.3.2 293 TX细胞的传代 | 第37页 |
| 3.3.3 293 TX细胞的冻存 | 第37-38页 |
| 3.3.4 慢病毒的包装 | 第38-39页 |
| 3.3.5 慢病毒的浓缩 | 第39-40页 |
| 3.3.6 病毒滴度的检测 | 第40页 |
| 3.3.7 重组表达质粒转染293TX细胞 | 第40页 |
| 3.3.8 嘌呤霉素筛选细胞 | 第40-41页 |
| 3.3.9 跨膜蛋白CAR的提取 | 第41页 |
| 3.3.10 WesternBlot检测CAR蛋白的表达 | 第41-43页 |
| 3.3.11 免疫荧光成像 | 第43页 |
| 3.3.12 scFvCAR的荧光成像 | 第43页 |
| 3.4 实验结果与讨论 | 第43-47页 |
| 3.4.1 慢病毒的浓缩 | 第43页 |
| 3.4.2 病毒滴度的检测 | 第43-44页 |
| 3.4.3 嘌呤霉素筛选CAR修饰的293TX细胞 | 第44页 |
| 3.4.4 WesternBlot检测CAR蛋白的表达 | 第44-45页 |
| 3.4.5 ZHER2CAR的免疫荧光成像 | 第45-46页 |
| 3.4.6 scFvCAR荧光成像与免疫荧光成像 | 第46-47页 |
| 3.5 本章小结 | 第47-49页 |
| 第4章 anti-HER2CAR-NK细胞的构建和细胞毒性研究 | 第49-53页 |
| 4.1 实验材料和试剂 | 第49页 |
| 4.1.1 细胞与实验试剂 | 第49页 |
| 4.1.2 主要溶液配制 | 第49页 |
| 4.2 实验仪器 | 第49页 |
| 4.3 实验方法 | 第49-51页 |
| 4.3.1 NK-92MI细胞的转染 | 第49-50页 |
| 4.3.2 CAR-NK细胞的筛选 | 第50页 |
| 4.3.3 CAR-NK细胞的荧光成像 | 第50页 |
| 4.3.4 CAR-NK细胞的杀伤实验 | 第50-51页 |
| 4.4 实验结果与讨论 | 第51-52页 |
| 4.4.1 嘌呤霉素筛选CAR-NK细胞 | 第51页 |
| 4.4.2 CAR-NK细胞的荧光成像 | 第51页 |
| 4.4.3 CAR-NK细胞的体外杀伤实验 | 第51-52页 |
| 4.5 本章小结 | 第52-53页 |
| 结论 | 第53-55页 |
| 参考文献 | 第55-61页 |
| 附录 | 第61-63页 |
| 攻读硕士学位期间科研成果 | 第63-65页 |
| 致谢 | 第65页 |
