| 摘要 | 第4-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 1 绪论 | 第10-21页 |
| 1.1 引言 | 第10页 |
| 1.2 IFN家族成员 | 第10-12页 |
| 1.2.1 Ⅰ型IFNs | 第10-11页 |
| 1.2.2 Ⅱ型IFNs | 第11页 |
| 1.2.3 Ⅲ型IFNs | 第11-12页 |
| 1.3 Ⅰ型Ⅱ型IFN基本信号通路的概述 | 第12-13页 |
| 1.4 Ⅰ型IFN对病毒的控制和免疫调节 | 第13-15页 |
| 1.4.1 病毒侵染后的先天性免疫受体通路 | 第13-14页 |
| 1.4.2 Ⅰ型IFN的免疫调节功能 | 第14-15页 |
| 1.5 肿瘤抑制因子p53 | 第15-18页 |
| 1.5.1 IFNα/β诱导p53蛋白 | 第15-16页 |
| 1.5.2 细胞间p53的交流 | 第16-17页 |
| 1.5.3 Mdm2与p53之间的关系 | 第17-18页 |
| 1.6 自噬和适应性免疫 | 第18-19页 |
| 1.7 凋亡在病毒感染下的生理意义 | 第19-20页 |
| 1.8 研究目的与意义 | 第20-21页 |
| 2 研究的主要内容 | 第21-38页 |
| 2.1 试验材料 | 第21-23页 |
| 2.1.1 细胞、病毒 | 第21页 |
| 2.1.2 菌株与质粒 | 第21页 |
| 2.1.3 抗体及相关试剂 | 第21-22页 |
| 2.1.4 主要仪器 | 第22页 |
| 2.1.5 试剂配制 | 第22-23页 |
| 2.2 鸽IFN-a基因的克隆 | 第23-27页 |
| 2.2.1 鸽RNA的提取 | 第23页 |
| 2.2.2 鸽IFN-α基因侧翼序列的扩增 | 第23-26页 |
| 2.2.3 鸽IFN-α基因ORF的校对 | 第26-27页 |
| 2.3 鸽IFN-α序列提交Genbank和序列分析 | 第27-28页 |
| 2.3.1 序列提交 | 第27页 |
| 2.3.2 进化分析 | 第27页 |
| 2.3.3 同源性分析 | 第27页 |
| 2.3.4 氨基酸序列对比 | 第27-28页 |
| 2.3.5 3D结构预测 | 第28页 |
| 2.3.6 信号肽和糖基化位点分析 | 第28页 |
| 2.4 鸽IFN-α基因的原核表达 | 第28-31页 |
| 2.4.1 鸽IFN-α成熟肽基因的克隆与鉴定 | 第28页 |
| 2.4.2 原核表达载体的构建 | 第28-29页 |
| 2.4.3 鸽IFN-α的原核表达、纯化和复性 | 第29-30页 |
| 2.4.4 重组鸽IFN-α理化性质分析 | 第30-31页 |
| 2.5 鸽IFN-α的抗病毒活性分析 | 第31-34页 |
| 2.5.1 鸡胚成纤维细胞的制作 | 第31页 |
| 2.5.2 病毒TCID_(50)的测定 | 第31-32页 |
| 2.5.3 鸽IFN-α与鸡IFN-α抗病毒活性的对比 | 第32页 |
| 2.5.4 鸽IFN-α和鸡IFN-α抗VSV下NF-κB表达量检测 | 第32-34页 |
| 2.6 鸽IFN-α在抗病毒过程中p53对IFN-α信号通路的影响 | 第34-37页 |
| 2.6.1 化学合成siRNA-p53转染 | 第34-35页 |
| 2.6.2 细胞实验分组 | 第35页 |
| 2.6.3 qPCR法对细胞中IFN-α通路、凋亡、自噬相关基因mRNA水平的检测 | 第35-37页 |
| 2.6.4 蛋白免疫印迹(Western blotting) | 第37页 |
| 2.7 数据统计 | 第37-38页 |
| 3 实验结果 | 第38-55页 |
| 3.1 鸽IFN-α的ORF克隆 | 第38-39页 |
| 3.1.1 步移法对鸽IFN-α基因3'侧翼序列的PCR扩增结果 | 第38页 |
| 3.1.2 步移法对鸽IFN-α基因5'侧翼序列的PCR扩增结果 | 第38-39页 |
| 3.1.3 鸽IFN-α基因ORF特异性扩增 | 第39页 |
| 3.2 鸽IFN-α基因的序列分析 | 第39-42页 |
| 3.3 鸽IFN-α基因的原核表达 | 第42-45页 |
| 3.3.1 鸽IFN-α基因的原核表达载体的构建 | 第42-44页 |
| 3.3.2 鸽IFN-α基因的原核表达 | 第44页 |
| 3.3.3 重组鸽IFN-α蛋白包涵体纯化 | 第44-45页 |
| 3.4 鸽IFN-α与鸡IFN-α抗病毒活性对比 | 第45-46页 |
| 3.4.1 鸽IFN-α与鸡IFN-α抗VSV、AIV和NDV活性 | 第45页 |
| 3.4.2 鸽IFN-α和鸡IFN-α在抗VSV中对NF-κB表达的影响 | 第45-46页 |
| 3.5 重组鸽IFN-α理化性质分析 | 第46-47页 |
| 3.5.1 重组鸽IFN-α胰酶敏感性分析 | 第46页 |
| 3.5.2 重组鸽IFN-α对酸碱敏感性分析 | 第46-47页 |
| 3.5.3 重组鸽IFN-α对温度敏感性分析 | 第47页 |
| 3.6 p53对鸽IFN-α抗病毒活性的影响 | 第47-54页 |
| 3.6.1 siRNA-p53干扰效率摸索及p53敲低模型的建立 | 第47-48页 |
| 3.6.2 倒置显微镜观察细胞形态 | 第48-49页 |
| 3.6.3 p53敲低对鸽IFN-α抗病毒过程中干扰素通路相关基因mRNA表达水平变化 | 第49页 |
| 3.6.4 p53敲低对鸽IFN-α抗病毒过程中凋亡相关基因mRNA水平变化 | 第49-50页 |
| 3.6.5 p53敲低对鸽IFN-α抗病毒过程中自噬相关基因mRNA水平变化 | 第50-51页 |
| 3.6.6 p53敲低对鸽IFN-α抗病毒过程中IFN通路相关基因蛋白表达水平 | 第51页 |
| 3.6.7 p53敲低对鸽IFN-α抗病毒过程中凋亡相关基因蛋白表达水平 | 第51-52页 |
| 3.6.8 p53敲低对鸽IFN-α抗病毒过程中自噬相关基因蛋白表达水平 | 第52-53页 |
| 3.6.9 p53敲低对鸽IFN-α抗病毒过程中Mdm2的mRNA和蛋白表达水平 | 第53-54页 |
| 3.7 蛋白质相互作用分析 | 第54-55页 |
| 4 讨论 | 第55-60页 |
| 4.1 巢式PCR对鸽IFN-α基因的侧翼克隆 | 第55页 |
| 4.2 鸽IFN-α基因及编码产物的生物信息学分析 | 第55-56页 |
| 4.3 鸽IFN-α基因的原核表达 | 第56页 |
| 4.4 鸽IFN-α基因的理化性质 | 第56页 |
| 4.5 鸽IFN-α抗病毒活性分析 | 第56-57页 |
| 4.6 鸽IFN-α诱发抗病毒通路分析 | 第57-58页 |
| 4.7 p53的敲低对鸽IFN-α抗病毒的影响 | 第58-59页 |
| 4.8 鸽IFN-α抗病毒过程对Mdm2的影响 | 第59-60页 |
| 结论 | 第60-61页 |
| 参考文献 | 第61-71页 |
| 附录 | 第71-73页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 | 第73-75页 |
| 致谢 | 第75-76页 |
