| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 缩略词语索引表 | 第7-11页 |
| 第一章 绪论 | 第11-22页 |
| 1.1 N-糖基化概述 | 第11-12页 |
| 1.1.1 糖生物学 | 第11页 |
| 1.1.2 N-糖基化 | 第11-12页 |
| 1.2 多萜醇寡糖前体(DLO)的合成 | 第12-15页 |
| 1.2.1 DLO合成的概述 | 第12-13页 |
| 1.2.2 DLO合成相关基因的鉴定 | 第13页 |
| 1.2.3 DLO合成途径未解决的问题 | 第13-15页 |
| 1.3 DLO合成异常导致的先天性糖基化疾病(CDG) | 第15-17页 |
| 1.3.1 先天性糖基化疾病(CDG)的概述 | 第15页 |
| 1.3.2 DLO合成异常导致的CDG | 第15页 |
| 1.3.3 DLO途径相关的CDG诊断 | 第15-17页 |
| 1.4 高甘露糖型寡糖的合成 | 第17-20页 |
| 1.4.1 高甘露糖型寡糖的应用价值 | 第17-18页 |
| 1.4.2 高甘露糖型寡糖的化学合成 | 第18-19页 |
| 1.4.3 高甘露糖型寡糖的天然来源提取 | 第19页 |
| 1.4.4 高甘露糖型寡糖的化学酶法合成研究进展 | 第19-20页 |
| 1.5 立题依据及研究意义 | 第20页 |
| 1.6 本论文的主要研究内容 | 第20-22页 |
| 第二章 建立LC-MS定量检测技术用于Alg1的酶学性质研究 | 第22-36页 |
| 2.1 前言 | 第22页 |
| 2.2 材料与方法 | 第22-27页 |
| 2.2.1 菌种及质粒 | 第22-23页 |
| 2.2.2 主要试剂与仪器 | 第23页 |
| 2.2.3 培养基及溶液的配制 | 第23-24页 |
| 2.2.4 质粒构建 | 第24-25页 |
| 2.2.5 Alg1?TM重组蛋白表达 | 第25页 |
| 2.2.6 Alg1?TM重组蛋白的纯化 | 第25-26页 |
| 2.2.7 SDS-PAGE检测 | 第26页 |
| 2.2.8 Western Blot检测 | 第26页 |
| 2.2.9 Alg1?TM活性测量体系 | 第26-27页 |
| 2.2.10 Alg1?TM活性的LC-MS定量检测方法 | 第27页 |
| 2.2.11 Alg1?TM反应最终产物的立体结构鉴定 | 第27页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第27-34页 |
| 2.3.1 Alg1?TM重组蛋白的过量表达及纯化 | 第27-28页 |
| 2.3.2 Alg1?TM重组蛋白的底物化学合成 | 第28-29页 |
| 2.3.3 LC-MS定量分析Alg1?TM重组蛋白的活性 | 第29-30页 |
| 2.3.4 Alg1?TM重组蛋白的酶学性质研究 | 第30-32页 |
| 2.3.5 测定各种突变的Alg1?TM重组蛋白酶比活 | 第32-34页 |
| 2.4 本章小结 | 第34-36页 |
| 第三章 蛋白N-糖基化合成中Alg2的替代催化路线研究 | 第36-55页 |
| 3.1 前言 | 第36页 |
| 3.2 材料与方法 | 第36-40页 |
| 3.2.1 菌种及质粒 | 第36-37页 |
| 3.2.2 主要试剂与仪器 | 第37页 |
| 3.2.3 酵母生长培养基及酵母破碎缓冲液的配制 | 第37页 |
| 3.2.4 质粒构建 | 第37-38页 |
| 3.2.5 Trx-Alg2重组蛋白的原核表达与纯化 | 第38页 |
| 3.2.6 对照大肠杆菌膜的制备 | 第38-39页 |
| 3.2.7 蛋白脂质体的制备 | 第39页 |
| 3.2.8 Trx-Alg2重组蛋白的活性测量体系 | 第39页 |
| 3.2.9 Trx-Alg2重组蛋白的LC-MS定量检测方法 | 第39页 |
| 3.2.10 Trx-Alg2反应中间产物及终产物的立体结构鉴定 | 第39页 |
| 3.2.11 酿酒酵母遗传改造菌株的构建 | 第39-40页 |
| 3.2.12 酿酒酵母回补实验菌株的点板实验 | 第40页 |
| 3.2.13 酿酒酵母膜蛋白的提取及Western Blot检测 | 第40页 |
| 3.3 结果 | 第40-51页 |
| 3.3.1 建立LC-MS定量方法确认Alg2的双功能甘露糖基转移酶功能 | 第40-43页 |
| 3.3.2 建立精确定量Alg2活性的评价标准 | 第43页 |
| 3.3.3 不同性质的Lipid对Trx-Alg2活性的影响 | 第43-44页 |
| 3.3.4 Trx-Alg2通过两种方式形成最终的产物PPGn2-Man3 | 第44-45页 |
| 3.3.5 Alg2的保守性EX_7E motif功能研究 | 第45-48页 |
| 3.3.6 Alg2的N-端细胞质区的短肽结构功能研究 | 第48-49页 |
| 3.3.7 Alg2的3个保守性G-rich motifs研究 | 第49-51页 |
| 3.4 讨论 | 第51-54页 |
| 3.5 本章小结 | 第54-55页 |
| 第四章 建立LC-MS定量检测技术用于ALG11-CDG的疾病严重程度研究 | 第55-65页 |
| 4.1 前言 | 第55页 |
| 4.2 材料与方法 | 第55-57页 |
| 4.2.1 菌种及质粒 | 第55页 |
| 4.2.2 主要试剂与仪器 | 第55页 |
| 4.2.3 培养基及溶液的配制 | 第55-56页 |
| 4.2.4 质粒构建 | 第56页 |
| 4.2.5 Alg11重组蛋白的表达 | 第56页 |
| 4.2.6 含有人Alg11重组蛋白的大肠杆菌膜成份制备 | 第56页 |
| 4.2.7 Western Blot检测 | 第56页 |
| 4.2.8 Alg11重组蛋白的活性测量体系 | 第56页 |
| 4.2.9 Alg11重组蛋白活性的LC-MS定量检测方法 | 第56-57页 |
| 4.2.10 Alg11重组蛋白反应产物的立体结构鉴定 | 第57页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第57-63页 |
| 4.3.1 LC-MS定量分析人Alg11重组蛋白的活性 | 第57-58页 |
| 4.3.2 Alg11的受体底物特异性研究 | 第58-59页 |
| 4.3.3 定量研究ALG11-CDG相关突变的活性 | 第59-62页 |
| 4.3.4 鉴定影响Alg11活性的保守性氨基酸 | 第62-63页 |
| 4.4 本章小结 | 第63-65页 |
| 第五章 化学酶法合成植烷醇连接的高甘露糖型寡糖 | 第65-79页 |
| 5.1 前言 | 第65页 |
| 5.2 材料与方法 | 第65-68页 |
| 5.2.1 菌种及质粒 | 第65页 |
| 5.2.2 主要试剂与仪器 | 第65页 |
| 5.2.3 培养基及溶液的配制 | 第65-66页 |
| 5.2.4 质粒构建 | 第66页 |
| 5.2.5 重组蛋白的表达 | 第66页 |
| 5.2.6 Alg11?TM重组蛋白的纯化 | 第66-67页 |
| 5.2.7 Dpm1重组蛋白的纯化 | 第67页 |
| 5.2.8 含有M-Alg3、M-Alg9及Alg12重组蛋白的大肠杆菌膜成份制备 | 第67页 |
| 5.2.9 Western Blot检测 | 第67页 |
| 5.2.10 Phy-P-Man的制备 | 第67页 |
| 5.2.11 Alg重组蛋白的活性测量体系 | 第67页 |
| 5.2.12 Alg重组蛋白活性的LC-MS定量检测方法 | 第67页 |
| 5.2.13 Alg重组蛋白反应产物的立体结构鉴定 | 第67-68页 |
| 5.3 结果与讨论 | 第68-77页 |
| 5.3.1 甘露糖基转移酶Alg的原核表达纯化及膜成份制备 | 第68-69页 |
| 5.3.2 化学酶法合成PP-M(1-5) | 第69页 |
| 5.3.3 化学酶法合成Phy-P-Man | 第69-70页 |
| 5.3.4 化学酶法合成PP-M(6-9) | 第70-72页 |
| 5.3.5 高甘露糖型寡糖的立体结构鉴定 | 第72-74页 |
| 5.3.6 各种Alg蛋白的底物特异性研究 | 第74-76页 |
| 5.3.7 化学酶法合成不常见的高甘露糖型寡糖 | 第76-77页 |
| 5.4 本章小结 | 第77-79页 |
| 主要结论与展望 | 第79-82页 |
| 主要结论 | 第79-81页 |
| 展望 | 第81-82页 |
| 论文重要创新点 | 第82-83页 |
| 致谢 | 第83-84页 |
| 参考文献 | 第84-91页 |
| 附录：作者在攻读博士学位期间发表的文章 | 第91页 |
