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水稻细菌性条斑病菌群体感应调控的致病相关基因鉴定与功能分析

摘要第11-13页
ABSTRACT第13-15页
上篇 文献综述第16-53页
    第一章 水稻细菌性条斑病菌的致病因子及与水稻互作的研究进展第17-35页
        1 黄单胞属病原菌的分类及危害第17-19页
        2 水稻细菌性条斑病菌的分类、生物学特性、分布及危害第19-23页
            2.1 分类第19-20页
            2.2 生物学特性及引发的病害症状第20-21页
            2.3 分布及危害第21-22页
            2.4 水稻条斑病菌的致病性分化第22-23页
        3 水稻细菌性条斑病菌的毒性因子第23-27页
            3.1 胞外多糖第23-24页
            3.2 毒性相关的外泌蛋白酶第24-26页
                3.2.1 果胶酶第25-26页
                3.2.2 纤维素酶第26页
                3.2.3 蛋白酶第26页
            3.3 毒素第26-27页
            3.4 生长调节物质第27页
        4 水稻细菌性条斑病菌-水稻的互作研究进展第27-33页
            4.1 T3SS在水稻细菌性条斑病菌-水稻互作过程中扮演关键角色第27-31页
            4.2 效应蛋白干扰寄主细胞的生物学过程第31-32页
                4.2.1 YopJ/AvrRxv第31页
                4.2.2 AvrBs3/PthA第31-32页
            4.3 氧化压力是水稻细菌性条斑病细菌成功侵染水稻的一个屏障第32-33页
        5 展望第33-35页
    第二章 黄单胞菌群体感应研究进展第35-53页
        1 主要的细菌群体感应类型第35-36页
            1.1 细菌的群体感应与群体行为第35页
            1.2 原核生物群体感应的发现及主要类型第35-36页
        2 依赖AHLs的群体感应系统第36-39页
        3 依赖AI-2的群体感应系统第39-40页
        4 依赖DSF的群体感应系统第40-51页
            4.1 DSF群体感应信号分子的发现第40-43页
            4.2 双组分系统RpfC/RpfG对DSF信号的感应及转换第43-44页
            4.3 DSF对第二信使cyclic di-GMP的调控第44-49页
                4.3.1 第二信使核苷酸第44-46页
                4.3.2 cyclic di-GMP及其与DSF的关系第46-47页
                4.3.3 Clp是DSF信号转导网络中的关键节点第47-49页
            4.4 DSF生物合成的自诱导机制第49-51页
        5 DSF家族信号分子参与种间信息交流第51-52页
        6 展望第52-53页
下篇 研究内容第53-147页
    第一章 水稻细菌性条斑病菌RPF基因簇的功能分析第55-85页
        1 引言第56-57页
        2 材料与方法第57-69页
            2.1 菌株、质粒和培养条件第57-58页
            2.2 引物的设计与合成第58-59页
            2.3 培养基第59-60页
            2.4 酶、抗生素、试剂盒和化学试剂第60页
            2.5 DNA操作体系第60-62页
                2.5.1 Taq DNA聚合酶PCR体系第60页
                2.5.2 PrimerSTAR HS DNA聚合酶PCR体系第60-61页
                2.5.3 酶切体系第61页
                2.5.4 Taq DNA聚合酶PCR产物连接体系第61页
                2.5.5 纯化酶切产物的连接体系第61-62页
            2.6 细菌基因组DNA的提取第62页
            2.7 水稻细菌性条斑病菌Rs105菌株rpf基因簇的克隆第62页
            2.8 rpf基因突变体的构建第62-63页
            2.9 连接产物转化大肠杆菌第63-64页
                2.9.1 大肠杆菌DH5 α化学感受态细胞的制备第63页
                2.9.2 连接产物的热激转化及阳性克隆的筛选第63-64页
            2.10 质粒的提取与酶切验证第64页
            2.11 水稻细菌性条斑病菌电转化及缺失突变体的筛选第64-65页
                2.11.1 水稻细菌性条斑病菌的电转化感受态细胞的制备第64-65页
                2.11.2 重组质粒电转化到水稻细菌性条斑病菌中第65页
                2.11.3 缺失突变体的筛选第65页
            2.12 Southern Blot验证第65-68页
                2.12.1 杂交溶液的配制第65-66页
                2.12.2 探针的制备第66页
                2.12.3 杂交膜的制备第66-68页
            2.13 互补菌株的构建第68页
            2.14 群体感应信号分子DSF检测第68页
            2.15 致病性测定第68-69页
            2.16 胞外多糖EPS的定量第69页
            2.17 细菌的聚集和驱散试验第69页
            2.18 过敏反应HR测定第69页
        3 结果第69-82页
            3.1 水稻细菌性条斑病菌中rpf基因簇同族体的鉴定第69-70页
            3.2 重组自杀载体的构建及验证第70-71页
            3.3 rpf基因簇各基因缺失突变体的获得第71-72页
            3.4 rpf基因缺失突变体的互补菌株构建(以rpfF基因为例)第72-73页
            3.5 rpf基因簇对DSF信号分子生物合成的影响第73-74页
                3.5.1 rpfF是水稻细菌性条斑病菌合成DSF所必需的第73-74页
                3.5.2 rpfC和rpfG影响水稻细菌条斑病菌的DSF生物合成第74页
            3.6 rpf基因突变体表型分析第74-82页
                3.6.1 rpfF基因突变体表型第74-78页
                3.6.2 rpfC、rpfG和rpfGC基因突变体表型第78-82页
        4 讨论第82-85页
    第二章 水稻细菌性条斑病菌DSF型群体感应系统调控的胞内蛋白质组比较分析第85-103页
        1 引言第85-86页
        2 材料与方法第86-96页
            2.1 蛋白质的提取与纯化第86-87页
                2.1.1 细菌菌株及培养条件第86页
                2.1.2 总蛋白的提取及纯化第86-87页
            2.2 向等电点聚焦第87-89页
                2.2.1 蛋白质的定量第87页
                2.2.2 上样第87-88页
                2.2.3 干胶条泡胀第88页
                2.2.4 等电点聚焦第88-89页
                2.2.5 胶条的保存第89页
            2.3 二向SDS-PAGE第89-92页
                2.3.1 灌胶第89-91页
                2.3.2 玻璃板、电泳槽等的准备第91页
                2.3.3 胶条的平衡第91-92页
                2.3.4 SDS-PAGE电泳第92页
            2.4 染色第92-94页
                2.4.1 凝胶的转移第92-93页
                2.4.2 银染第93页
                2.4.3 考染第93-94页
                2.4.4 凝胶的保存第94页
            2.5 图像分析第94页
            2.6 质谱分析第94-96页
                2.6.1 挖点第94页
                2.6.2 斑点的处理第94-95页
                2.6.3 酶切第95页
                2.6.4 肽段浓缩除盐第95页
                2.6.5 质谱检测第95-96页
                2.6.6 数据库检索第96页
        3 结果第96-98页
            3.1 水稻细菌性条斑病菌野生型菌株和rpfF缺失突变株蛋白质组比较分析第96-98页
            3.2 差异表达蛋白质的鉴定和功能分析第98页
        4 讨论第98-103页
    第三章 水稻细菌性条斑病菌中受群体感应调控的新颖致病相关基因hshB的鉴定和功能分析第103-127页
        1 引言第104页
        2 材料与方法第104-111页
            2.1 菌株、质粒和培养条件第104-105页
            2.2 基因的缺失突变体构建及互补第105-107页
            2.3 Southern Blot验证第107页
            2.4 致病性和在水稻上的定殖能力测定第107页
            2.5 基本培养基中的生长曲线测定第107-108页
            2.6 DSF的提取第108页
            2.7 胞外多糖EPS的定量第108页
            2.8 胞外蛋白酶活性的测定第108页
            2.9 过氧化氢耐受性试验第108页
            2.10 噻枯唑耐受性试验第108页
            2.11 相对实时荧光定量PCR和反转录PCR第108-111页
                2.11.1 细菌总RNA的提取第108-109页
                2.11.2 RNA的纯化第109-110页
                2.11.3 RNA的质量与浓度检测第110页
                2.11.4 逆转录反应合成cDNA第110页
                2.11.5 相对实时荧光定量PCR第110-111页
                2.11.6 反转录PCR第111页
        3 结果第111-124页
            3.1 新颖毒性基因hshB的发现第111-113页
            3.2 黄单胞属细菌基因组中hshB同源基因及上下游核酸序列分析第113-117页
            3.3 DSF调控hshB的转录第117-118页
            3.4 clp基因的缺失突变显著削弱了水稻细菌性条斑病菌的致病性第118-119页
            3.5 hshB和clp调控水稻细菌性条斑病菌的胞外多糖和胞外蛋白酶生物合成第119-120页
            3.6 hshB和clp有助于水稻细菌性条斑病菌抵抗氧化压力和噻枯唑第120-122页
            3.7 hshB是水稻细菌性条斑病菌在基本培养中正常生长所必需的第122页
            3.8 全局性调控因子Clp调控hshB的转录第122-124页
        4 讨论第124-127页
    第四章 水稻细菌性条斑病菌群体感应调控的胞外蛋白质组比较分析第127-147页
        1 引言第128-129页
        2 材料与方法第129-134页
            2.1 细菌菌株及培养条件第129-131页
            2.2 胞外总蛋白的提取及纯化第131-132页
                2.2.1 胞外蛋白的提取步骤第131页
                2.2.2 提取胞外蛋白的SDS-PAGE验证第131-132页
                2.2.3 胞外蛋白的纯化第132页
            2.3 蛋白质双向电泳第132页
            2.4 质谱分析第132页
            2.5 鉴定蛋白的信号肽预测第132页
            2.6 鉴定外泌蛋白对应基因缺失突变体的构建第132-133页
            2.7 致病性测定第133-134页
        3 结果第134-143页
            3.1 胞外蛋白的提取第134-135页
            3.2 不同方式纯化的胞外蛋白质2-DE图谱比较第135页
            3.3 水稻细菌性条斑病菌野生型菌株和fpfF突变株胞外蛋白质组比较分析第135-138页
            3.4 差异表达蛋白质的鉴定和功能分析第138-141页
            3.5 DSF调控的部分外泌蛋白是水稻细菌性条斑病菌保持完整致病性所必需的第141-143页
        4 讨论第143-147页
全文总结第147-149页
本论文创新点第149-151页
参考文献第151-171页
致谢第171-173页
攻读博士学位期间发表论文第173页

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