| 摘要 | 第3-4页 |
| Abstract | 第4-5页 |
| 第1章 引言 | 第12-38页 |
| 1.1 蛋白质相互作用结构域 | 第12-13页 |
| 1.2 PB1 结构域 | 第13-22页 |
| 1.2.1 PB1 结构域的发现和分类 | 第13-18页 |
| 1.2.2 PB1 结构域的结构 | 第18-19页 |
| 1.2.3 PB1 结构域的相互识别 | 第19-22页 |
| 1.3 含有 PB1 结构域的蛋白和所参与的信号通路 | 第22-34页 |
| 1.3.1 aPKC、Par-6 和细胞极性调控 | 第23-28页 |
| 1.3.2 p62 和 NF-κB 信号通路 | 第28-32页 |
| 1.3.3 MEK5、MEKK2/3 和 ERK5 信号通路 | 第32-33页 |
| 1.3.4 NBR1 和细胞自噬 | 第33-34页 |
| 1.4 PB1 结构域相互作用的调控 | 第34-36页 |
| 1.4.1 小分子修饰对相互作用的影响 | 第34-35页 |
| 1.4.2 相互作用对 aPKC 的活力调控 | 第35-36页 |
| 1.5 本文主要研究内容和意义 | 第36-38页 |
| 第2章 材料和方法 | 第38-70页 |
| 2.1 本章引论 | 第38页 |
| 2.2 原核表达质粒构建 | 第38-46页 |
| 2.2.1 cDNA、菌种和相关试剂 | 第38-40页 |
| 2.2.2 插入片段和载体制备 | 第40-42页 |
| 2.2.3 阳性克隆筛选 | 第42-43页 |
| 2.2.4 突变体构建 | 第43-46页 |
| 2.3 蛋白表达 | 第46-48页 |
| 2.3.1 蛋白性质分析 | 第46页 |
| 2.3.2 蛋白产量和可溶性分析 | 第46-47页 |
| 2.3.3 大量表达 | 第47-48页 |
| 2.4 蛋白纯化 | 第48-53页 |
| 2.4.1 相关试剂和柱材 | 第49页 |
| 2.4.2 亲和层析 | 第49-51页 |
| 2.4.3 离子交换层析 | 第51-52页 |
| 2.4.4 分子筛层析 | 第52-53页 |
| 2.5 分子筛层析检测蛋白-蛋白相互作用 | 第53-54页 |
| 2.5.1 蛋白浓度测定 | 第53页 |
| 2.5.2 操作流程 | 第53-54页 |
| 2.6 免疫共沉淀检测蛋白-蛋白相互作用 | 第54-55页 |
| 2.6.1 真核表达质粒构建 | 第54页 |
| 2.6.2 细胞培养和传代 | 第54页 |
| 2.6.3 免疫共沉淀 | 第54-55页 |
| 2.6.4 蛋白质印迹 | 第55页 |
| 2.7 GST 标签介导的 pull-down 检测蛋白-蛋白相互作用 | 第55-56页 |
| 2.8 蛋白质结晶 | 第56-62页 |
| 2.8.1 结晶样品制备 | 第57-58页 |
| 2.8.2 结晶条件筛选 | 第58-60页 |
| 2.8.3 晶体优化 | 第60-62页 |
| 2.8.4 衍射初试 | 第62页 |
| 2.9 数据收集和处理 | 第62-64页 |
| 2.9.1 数据收集 | 第63页 |
| 2.9.2 数据处理 | 第63-64页 |
| 2.10 相位问题和结构解析 | 第64-65页 |
| 2.10.1 解决相位问题的方法 | 第64-65页 |
| 2.10.2 结构模型建立和修正 | 第65页 |
| 2.10.3 质量检测 | 第65页 |
| 2.11 半胱氨酸残基修饰 | 第65-66页 |
| 2.12 ITC 测定蛋白-蛋白相互作用的强弱 | 第66-70页 |
| 2.12.1 基本原理 | 第67-69页 |
| 2.12.2 操作流程 | 第69-70页 |
| 第3章 aPKC-PB1 和 p62-PB1 的相互作用验证 | 第70-80页 |
| 3.1 实验思路 | 第70页 |
| 3.2 用于原核表达的质粒和蛋白性质分析 | 第70-71页 |
| 3.3 aPKC-PB1 蛋白纯化 | 第71-74页 |
| 3.4 p62-PB1 蛋白纯化 | 第74-76页 |
| 3.5 aPKC-PB1 结合 p62-PB1AM 而非 p62-PB1BM | 第76-78页 |
| 3.6 PB1 结构域在 aPKC 和 p62 相互作用中的必要性 | 第78-79页 |
| 3.7 小结 | 第79-80页 |
| 第4章 aPKC-p62 PB1 复合物的晶体结构解析 | 第80-104页 |
| 4.1 实验思路 | 第80页 |
| 4.2 aPKC-p62 PB1 复合物蛋白纯化 | 第80-84页 |
| 4.3 aPKC-p62 PB1 野生型复合物晶体的优化 | 第84-86页 |
| 4.4 aPKC-PB1 和 p62-PB1AM 复合物晶体的优化 | 第86-87页 |
| 4.5 数据收集和结构解析 | 第87-90页 |
| 4.6 结构分析和验证 | 第90-103页 |
| 4.6.1 aPKC-p62AM PB1 复合物晶体结构高度相似 | 第91-92页 |
| 4.6.2 PKCζ-p62AM PB1 复合物晶体结构描述 | 第92-93页 |
| 4.6.3 相互作用界面分析 | 第93-96页 |
| 4.6.4 静电相互作用的重要性 | 第96-98页 |
| 4.6.5 与已有 PB1 复合物结构比较 | 第98-100页 |
| 4.6.6 aPKC-PB1 属于 I 型 PB1 | 第100-103页 |
| 4.7 小结 | 第103-104页 |
| 第5章 PKCζ-p62 PB1 复合物的相关调控 | 第104-114页 |
| 5.1 实验思路 | 第104页 |
| 5.2 ATM 对 PKCζ-PB1 的修饰破坏 PKCζ-p62 PB1 复合物形成 | 第104-110页 |
| 5.2.1 修饰后 PKCζ-PB1 失去和 p62-PB1 相互作用的能力 | 第104-106页 |
| 5.2.2 ATM 修饰 PKCζ-PB1 中的所有半胱氨酸残基 | 第106-109页 |
| 5.2.3 Cys68 在 ATM 对 PKCζ-p62 PB1 的破坏起决定作用 | 第109-110页 |
| 5.3 PKCζ-PB1 通过相互作用解离 p62-PB1 高聚体 | 第110-113页 |
| 5.3.1 p62-PB1 自身聚合能力 | 第110-111页 |
| 5.3.2 共转发现 PKCζ-PB1 对 p62-PB1 的解聚 | 第111页 |
| 5.3.3 PKCζ-PB1 从同源二聚体中竞争出 p62-PB1AM | 第111-113页 |
| 5.4 小结 | 第113-114页 |
| 第6章 p62-PB1 介导与多种蛋白的相互作用 | 第114-127页 |
| 6.1 实验思路 | 第114页 |
| 6.2 p62-PB1 与其它蛋白 PB1 结构域的相互作用情况 | 第114-120页 |
| 6.2.1 各 PB1 结构域蛋白纯化 | 第114-118页 |
| 6.2.2 ITC 测定 p62-PB1 和不同 PB1 的结合能力 | 第118-120页 |
| 6.3 MEK5-p62 PB1 复合物的晶体结构解析 | 第120-126页 |
| 6.3.1 MEK5-p62 PB1 复合物蛋白纯化 | 第120-121页 |
| 6.3.2 MEK5-PB1 和 p62-PB1AM 复合物晶体的优化 | 第121-122页 |
| 6.3.3 数据收集和结构解析 | 第122-123页 |
| 6.3.4 结构分析 | 第123-126页 |
| 6.4 小结 | 第126-127页 |
| 第7章 总结和展望 | 第127-133页 |
| 7.1 本章引论 | 第127页 |
| 7.2 总结 | 第127-129页 |
| 7.3 讨论 | 第129-131页 |
| 7.3.1 PB1 结构域结合模式的普遍规律和特异性 | 第129-130页 |
| 7.3.2 ATM 的作用机制 | 第130页 |
| 7.3.3 PKCζ在 NF-κB 信号通路中的功能 | 第130-131页 |
| 7.4 展望 | 第131-133页 |
| 参考文献 | 第133-142页 |
| 致谢 | 第142-144页 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果 | 第144页 |
