| 摘要 | 第4-5页 |
| Abstract | 第5页 |
| 1 引言 | 第9-20页 |
| 1.1. COI1蛋白概述 | 第10-14页 |
| 1.1.1. COI1蛋白对茉莉素信号转导途径的重要性 | 第10-12页 |
| 1.1.2. COI1蛋白的发现 | 第12-14页 |
| 1.1.3. COI1蛋白的功能 | 第14页 |
| 1.2. 植物激素茉莉素信号转导途径 | 第14-16页 |
| 1.2.1. 茉莉素生物学功能研究 | 第14-15页 |
| 1.2.2. 茉莉素信号转导机制的研究 | 第15-16页 |
| 1.3. F-box蛋白的功能及研究现状 | 第16-17页 |
| 1.4. 蛋白质的表达与纯化 | 第17-18页 |
| 1.4.1. 蛋白表达体系 | 第17-18页 |
| 1.4.2. 各种表达系统的利弊 | 第18页 |
| 1.4.3. 蛋白质纯化 | 第18页 |
| 1.5. 本研究的目的和意义 | 第18-19页 |
| 1.6. 技术路线 | 第19-20页 |
| 2 材料与方法 | 第20-40页 |
| 2.1. 材料与试剂 | 第20页 |
| 2.1.1. 植物材料 | 第20页 |
| 2.1.2. 质粒及菌株 | 第20页 |
| 2.1.3. 试剂 | 第20页 |
| 2.2. RNA提取 | 第20-21页 |
| 2.3. 反转录 | 第21-22页 |
| 2.4. 原核表达体系构建 | 第22-27页 |
| 2.4.1. 载体构建 | 第22-26页 |
| 2.4.1.1. COI1基因扩增 | 第22页 |
| 2.4.1.2. PCR产物纯化 | 第22-23页 |
| 2.4.1.3. 双酶切 | 第23-24页 |
| 2.4.1.4. 胶回收 | 第24页 |
| 2.4.1.5. 连接反应 | 第24-25页 |
| 2.4.1.6. 热激法转化DH5α | 第25页 |
| 2.4.1.7. 重组质粒提取 | 第25-26页 |
| 2.4.2. 重组蛋白表达 | 第26-27页 |
| 2.4.2.1. BL21表达宿主转化 | 第26页 |
| 2.4.2.2. COI1蛋白诱导表达 | 第26页 |
| 2.4.2.3. 蛋白表达检测 | 第26-27页 |
| 2.5. 真核表达体系的构建 | 第27-32页 |
| 2.5.1. 载体构建 | 第27页 |
| 2.5.2. DH10Bac感受态细胞的制备 | 第27-28页 |
| 2.5.3. DH10Bac转化 | 第28页 |
| 2.5.4. Bacmid提取 | 第28-29页 |
| 2.5.5. DH10Bac鉴定 | 第29-30页 |
| 2.5.6. 昆虫细胞培养 | 第30-31页 |
| 2.5.7. 昆虫细胞转染(所有操作均在超净台中完成) | 第31页 |
| 2.5.8. P1代病毒的检测(Western Blot) | 第31-32页 |
| 2.5.9. P2代病毒的培养 | 第32页 |
| 2.5.10. 蛋白表达可溶性检测 | 第32页 |
| 2.5.11. P3代病毒培养 | 第32页 |
| 2.6. 寻找稳定COI1表达的helper蛋白 | 第32-33页 |
| 2.6.1. 载体构建 | 第32-33页 |
| 2.6.2. 共表达 | 第33页 |
| 2.6.3. 表达结果检测 | 第33页 |
| 2.7. COI1蛋白与ASK1的共表达 | 第33-35页 |
| 2.7.1. 共转细胞考染检测表达情况 | 第33-34页 |
| 2.7.2. 蛋白浓度测定(BSA测定) | 第34页 |
| 2.7.3. COI1蛋白活性测定Pull down Assay | 第34-35页 |
| 2.7.3.1. 蛋白的准备 | 第34-35页 |
| 2.7.3.2. Pull-down assay | 第35页 |
| 2.8. COI1蛋白的纯化(小量) | 第35-37页 |
| 2.8.1. 亲和纯化法的比较 | 第35-36页 |
| 2.8.2. 不同纯化方法活性的测定 | 第36-37页 |
| 2.9. 大量蛋白纯化条件摸索(蛋白纯化系统Akta的使用) | 第37-39页 |
| 2.9.1. 离子交换柱的使用 | 第37页 |
| 2.9.2. 分子筛的使用 | 第37-38页 |
| 2.9.3. 蛋白质活性检测 | 第38-39页 |
| 2.10. AtCOI1同源蛋白表达 | 第39-40页 |
| 3 结果与分析 | 第40-51页 |
| 3.1. 原核表达体系 | 第40页 |
| 3.2. 真核表达体系 | 第40-44页 |
| 3.2.1. DH10Bac转化鉴定 | 第40-41页 |
| 3.2.2. 昆虫细胞转染及P1代病毒的检测 | 第41-42页 |
| 3.2.3. 辅助蛋白的寻找 | 第42-43页 |
| 3.2.4. COI1蛋白与ASK1蛋白共表达检测 | 第43-44页 |
| 3.3. COI1蛋白的纯化(小量) | 第44-46页 |
| 3.3.1. 亲和纯化法的比较 | 第44-45页 |
| 3.3.2. 不同纯化方法蛋白活性的比较 | 第45-46页 |
| 3.4. 大量蛋白纯化条件的摸索与确定 | 第46-50页 |
| 3.4.1. 蛋白纯化系统的使用 | 第46-49页 |
| 3.4.1.1. 离子交换柱的使用 | 第46-48页 |
| 3.4.1.2. 分子筛的使用 | 第48-49页 |
| 3.4.2. 纯化蛋白活性的检测 | 第49-50页 |
| 3.5. 同源蛋白的表达 | 第50-51页 |
| 4 讨论 | 第51-54页 |
| 5 结论 | 第54-55页 |
| 参考文献 | 第55-61页 |
| 附录 | 第61-63页 |
| 致谢 | 第63页 |
