| 致谢 | 第5-6页 |
| 摘要 | 第6-9页 |
| Abstract | 第9-12页 |
| 第一章 绪论 | 第18-43页 |
| 1.1 生物催化制造手性化学品 | 第18-20页 |
| 1.2 生物催化的不对称还原 | 第20-26页 |
| 1.3 卤代醇脱卤酶 | 第26-30页 |
| 1.4 面向工业应用的酶分子改造 | 第30-35页 |
| 1.5 多酶法生物合成 | 第35-41页 |
| 1.6 本课题的研究思路与主要内容 | 第41-43页 |
| 第二章 实验材料与方法 | 第43-64页 |
| 2.1 实验材料 | 第43-48页 |
| 2.1.1 菌种和质粒 | 第43-44页 |
| 2.1.2 主要实验仪器 | 第44-45页 |
| 2.1.3 主要药品与试剂 | 第45-48页 |
| 2.2 实验方法 | 第48-58页 |
| 2.2.1 培养基与试剂配制 | 第48-50页 |
| 2.2.2 菌种的保藏与活化 | 第50页 |
| 2.2.3 DNA合成与测序 | 第50页 |
| 2.2.4 细菌基因组的提取 | 第50-51页 |
| 2.2.5 质粒的提取 | 第51页 |
| 2.2.6 mRNA的提取 | 第51页 |
| 2.2.7 PCR扩增 | 第51-52页 |
| 2.2.8 DNA凝胶回收 | 第52页 |
| 2.2.9 酶切 | 第52页 |
| 2.2.10 酶连 | 第52页 |
| 2.2.11 感受态细胞的制备 | 第52-53页 |
| 2.2.12 转化 | 第53页 |
| 2.2.13 诱导 | 第53-54页 |
| 2.2.14 发酵罐培养 | 第54页 |
| 2.2.15 菌体收集与细胞破碎 | 第54页 |
| 2.2.16 电泳样品的制备 | 第54页 |
| 2.2.17 核酸琼脂糖凝胶电泳 | 第54-55页 |
| 2.2.18 蛋白质SDS-PAGE电泳 | 第55页 |
| 2.2.19 蛋白质的纯化 | 第55-56页 |
| 2.2.20 底物的合成与产物的衍生 | 第56-57页 |
| 2.2.21 生物催化反应及样品后处理 | 第57-58页 |
| 2.2.22 化合物的分离纯化与表征 | 第58页 |
| 2.3 分析方法 | 第58-64页 |
| 2.3.1 分析方法的建立 | 第58页 |
| 2.3.2 定量标准曲线的绘制 | 第58-61页 |
| 2.3.3 辅酶再生能力测定 | 第61页 |
| 2.3.4 蛋白质浓度的测定 | 第61页 |
| 2.3.5 氯离子浓度的测定 | 第61页 |
| 2.3.6 甘油含量的测定 | 第61页 |
| 2.3.7 氨基氮含量的测定 | 第61-64页 |
| 第三章 多酶体系的构建 | 第64-101页 |
| 3.1 前言 | 第64页 |
| 3.2 单酶的克隆表达 | 第64-74页 |
| 3.2.1 卤代醇脱卤酶HheC的克隆表达 | 第64-66页 |
| 3.2.2 醇脱氢酶AdhR的克隆表达 | 第66-68页 |
| 3.2.3 醇脱氢酶AdhS的克隆表达 | 第68-69页 |
| 3.2.4 葡萄糖脱氢酶GdhBS的克隆表达 | 第69-71页 |
| 3.2.5 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶GpdPP的克隆表达 | 第71-72页 |
| 3.2.6 甲酸脱氢酶FdhCB的克隆表达 | 第72-74页 |
| 3.3 双酶体系的构建 | 第74-80页 |
| 3.3.1 AdhR与HheC的共表达 | 第74-77页 |
| 3.3.2 AdhS与HheC的共表达 | 第77-80页 |
| 3.4 多酶体系的构建 | 第80-100页 |
| 3.4.1 AdhR辅酶(NADPH)再生的研究 | 第80-87页 |
| 3.4.2 AdhS辅酶(NADH)再生的研究 | 第87-94页 |
| 3.4.3 AdhR,GdhBS和HheC的共表达 | 第94-97页 |
| 3.4.4 AdhS,FdhCB和HheC的共表达 | 第97-100页 |
| 3.5 本章小结 | 第100-101页 |
| 第四章 卤代醇脱卤酶的半理性设计与多酶体系的改进 | 第101-113页 |
| 4.1 前言 | 第101页 |
| 4.2 卤代醇脱卤酶HHDH的克隆表达及特性研究 | 第101-103页 |
| 4.2.1 HHDH的克隆表达 | 第101-102页 |
| 4.2.2 HHDH的特性研究 | 第102-103页 |
| 4.3 卤代醇脱卤酶HHDH的酶分子改造 | 第103-107页 |
| 4.3.1 HHDH的底物COBE抑制动力学 | 第103-104页 |
| 4.3.2 HHDH的半理性设计 | 第104-107页 |
| 4.4 多酶体系的改进 | 第107-111页 |
| 4.4.1 AdhR,GdhS与HHDH的共表达及特性研究 | 第107-109页 |
| 4.4.2 AdhS,FdhCB与HHDH的共表达及特性研究 | 第109-110页 |
| 4.4.3 多酶体系稳定性的考察 | 第110-111页 |
| 4.5 本章小结 | 第111-113页 |
| 第五章 多酶体系的发酵工艺研究 | 第113-127页 |
| 5.1 前言 | 第113页 |
| 5.2 培养基的优化 | 第113-117页 |
| 5.2.1 不同碳源对重组菌发酵产酶条件的影响 | 第114-115页 |
| 5.2.2 不同氮源对重组菌发酵产酶条件的影响 | 第115-116页 |
| 5.2.3 响应面中心组合设计优化培养基配方 | 第116-117页 |
| 5.3 表达条件的优化 | 第117-123页 |
| 5.3.1 诱导温度的影响 | 第117-119页 |
| 5.3.2 诱导时机的影响 | 第119-120页 |
| 5.3.3 诱导强度的影响 | 第120-121页 |
| 5.3.4 诱导时间的影响 | 第121-123页 |
| 5.4 高密度发酵工艺研究 | 第123-126页 |
| 5.4.1 分批发酵 | 第123-125页 |
| 5.4.2 补料分批发酵 | 第125-126页 |
| 5.5 本章小结 | 第126-127页 |
| 第六章 手性β-羟基腈的合成 | 第127-141页 |
| 6.1 前言 | 第127页 |
| 6.2 单酶的底物谱分析 | 第127-132页 |
| 6.2.1 HheC的底物谱分析 | 第127-128页 |
| 6.2.2 HHDH的底物谱分析 | 第128-130页 |
| 6.2.3 AdhR的底物谱分析 | 第130-131页 |
| 6.2.4 AdhS的底物谱分析 | 第131-132页 |
| 6.3 多酶催化的手性β-羟基腈的合成 | 第132-133页 |
| 6.3.1 Eco_RBH催化的手性β-羟基腈的合成 | 第132-133页 |
| 6.3.2 Eco_SFH催化的手性β-羟基腈的合成 | 第133页 |
| 6.4 反应产物的进一步确认 | 第133-135页 |
| 6.5 工程菌Eco_RBH的催化工艺研究 | 第135-139页 |
| 6.5.1 温度、pH等因素的影响 | 第135-137页 |
| 6.5.2 提高底物浓度的研究 | 第137-139页 |
| 6.6 本章小结 | 第139-141页 |
| 第七章 一种手性多羟基腈的合成 | 第141-151页 |
| 7.1 前言 | 第141-142页 |
| 7.2 (3R,5S)6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的合成 | 第142-146页 |
| 7.2.1 体系构建与产物合成 | 第142-146页 |
| 7.3 (3R,5R)6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯的合成 | 第146-148页 |
| 7.3.1 体系构建与产物合成 | 第146-147页 |
| 7.3.2 工艺的研究 | 第147-148页 |
| 7.4 反应产物的进一步确认 | 第148-149页 |
| 7.5 本章小结 | 第149-151页 |
| 第八章 结论与展望 | 第151-155页 |
| 8.1 结论 | 第151-154页 |
| 8.2 展望 | 第154-155页 |
| 参考文献 | 第155-164页 |
| 附录A 本研究涉及的基因序列 | 第164-165页 |
| 附录B 引物列表 | 第165-168页 |
| 附录C 质粒图谱 | 第168-176页 |
| 附录D 色谱图 | 第176-194页 |
| 附录E 质谱图 | 第194-208页 |
| 附录F 核磁共振谱图 | 第208-222页 |
| 作者简历及在学期间所取得的科研成果 | 第222-223页 |
