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氧化还原酶—卤代醇脱卤酶多酶法合成手性β-羟基腈

致谢第5-6页
摘要第6-9页
Abstract第9-12页
第一章 绪论第18-43页
    1.1 生物催化制造手性化学品第18-20页
    1.2 生物催化的不对称还原第20-26页
    1.3 卤代醇脱卤酶第26-30页
    1.4 面向工业应用的酶分子改造第30-35页
    1.5 多酶法生物合成第35-41页
    1.6 本课题的研究思路与主要内容第41-43页
第二章 实验材料与方法第43-64页
    2.1 实验材料第43-48页
        2.1.1 菌种和质粒第43-44页
        2.1.2 主要实验仪器第44-45页
        2.1.3 主要药品与试剂第45-48页
    2.2 实验方法第48-58页
        2.2.1 培养基与试剂配制第48-50页
        2.2.2 菌种的保藏与活化第50页
        2.2.3 DNA合成与测序第50页
        2.2.4 细菌基因组的提取第50-51页
        2.2.5 质粒的提取第51页
        2.2.6 mRNA的提取第51页
        2.2.7 PCR扩增第51-52页
        2.2.8 DNA凝胶回收第52页
        2.2.9 酶切第52页
        2.2.10 酶连第52页
        2.2.11 感受态细胞的制备第52-53页
        2.2.12 转化第53页
        2.2.13 诱导第53-54页
        2.2.14 发酵罐培养第54页
        2.2.15 菌体收集与细胞破碎第54页
        2.2.16 电泳样品的制备第54页
        2.2.17 核酸琼脂糖凝胶电泳第54-55页
        2.2.18 蛋白质SDS-PAGE电泳第55页
        2.2.19 蛋白质的纯化第55-56页
        2.2.20 底物的合成与产物的衍生第56-57页
        2.2.21 生物催化反应及样品后处理第57-58页
        2.2.22 化合物的分离纯化与表征第58页
    2.3 分析方法第58-64页
        2.3.1 分析方法的建立第58页
        2.3.2 定量标准曲线的绘制第58-61页
        2.3.3 辅酶再生能力测定第61页
        2.3.4 蛋白质浓度的测定第61页
        2.3.5 氯离子浓度的测定第61页
        2.3.6 甘油含量的测定第61页
        2.3.7 氨基氮含量的测定第61-64页
第三章 多酶体系的构建第64-101页
    3.1 前言第64页
    3.2 单酶的克隆表达第64-74页
        3.2.1 卤代醇脱卤酶HheC的克隆表达第64-66页
        3.2.2 醇脱氢酶AdhR的克隆表达第66-68页
        3.2.3 醇脱氢酶AdhS的克隆表达第68-69页
        3.2.4 葡萄糖脱氢酶GdhBS的克隆表达第69-71页
        3.2.5 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶GpdPP的克隆表达第71-72页
        3.2.6 甲酸脱氢酶FdhCB的克隆表达第72-74页
    3.3 双酶体系的构建第74-80页
        3.3.1 AdhR与HheC的共表达第74-77页
        3.3.2 AdhS与HheC的共表达第77-80页
    3.4 多酶体系的构建第80-100页
        3.4.1 AdhR辅酶(NADPH)再生的研究第80-87页
        3.4.2 AdhS辅酶(NADH)再生的研究第87-94页
        3.4.3 AdhR,GdhBS和HheC的共表达第94-97页
        3.4.4 AdhS,FdhCB和HheC的共表达第97-100页
    3.5 本章小结第100-101页
第四章 卤代醇脱卤酶的半理性设计与多酶体系的改进第101-113页
    4.1 前言第101页
    4.2 卤代醇脱卤酶HHDH的克隆表达及特性研究第101-103页
        4.2.1 HHDH的克隆表达第101-102页
        4.2.2 HHDH的特性研究第102-103页
    4.3 卤代醇脱卤酶HHDH的酶分子改造第103-107页
        4.3.1 HHDH的底物COBE抑制动力学第103-104页
        4.3.2 HHDH的半理性设计第104-107页
    4.4 多酶体系的改进第107-111页
        4.4.1 AdhR,GdhS与HHDH的共表达及特性研究第107-109页
        4.4.2 AdhS,FdhCB与HHDH的共表达及特性研究第109-110页
        4.4.3 多酶体系稳定性的考察第110-111页
    4.5 本章小结第111-113页
第五章 多酶体系的发酵工艺研究第113-127页
    5.1 前言第113页
    5.2 培养基的优化第113-117页
        5.2.1 不同碳源对重组菌发酵产酶条件的影响第114-115页
        5.2.2 不同氮源对重组菌发酵产酶条件的影响第115-116页
        5.2.3 响应面中心组合设计优化培养基配方第116-117页
    5.3 表达条件的优化第117-123页
        5.3.1 诱导温度的影响第117-119页
        5.3.2 诱导时机的影响第119-120页
        5.3.3 诱导强度的影响第120-121页
        5.3.4 诱导时间的影响第121-123页
    5.4 高密度发酵工艺研究第123-126页
        5.4.1 分批发酵第123-125页
        5.4.2 补料分批发酵第125-126页
    5.5 本章小结第126-127页
第六章 手性β-羟基腈的合成第127-141页
    6.1 前言第127页
    6.2 单酶的底物谱分析第127-132页
        6.2.1 HheC的底物谱分析第127-128页
        6.2.2 HHDH的底物谱分析第128-130页
        6.2.3 AdhR的底物谱分析第130-131页
        6.2.4 AdhS的底物谱分析第131-132页
    6.3 多酶催化的手性β-羟基腈的合成第132-133页
        6.3.1 Eco_RBH催化的手性β-羟基腈的合成第132-133页
        6.3.2 Eco_SFH催化的手性β-羟基腈的合成第133页
    6.4 反应产物的进一步确认第133-135页
    6.5 工程菌Eco_RBH的催化工艺研究第135-139页
        6.5.1 温度、pH等因素的影响第135-137页
        6.5.2 提高底物浓度的研究第137-139页
    6.6 本章小结第139-141页
第七章 一种手性多羟基腈的合成第141-151页
    7.1 前言第141-142页
    7.2 (3R,5S)6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的合成第142-146页
        7.2.1 体系构建与产物合成第142-146页
    7.3 (3R,5R)6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯的合成第146-148页
        7.3.1 体系构建与产物合成第146-147页
        7.3.2 工艺的研究第147-148页
    7.4 反应产物的进一步确认第148-149页
    7.5 本章小结第149-151页
第八章 结论与展望第151-155页
    8.1 结论第151-154页
    8.2 展望第154-155页
参考文献第155-164页
附录A 本研究涉及的基因序列第164-165页
附录B 引物列表第165-168页
附录C 质粒图谱第168-176页
附录D 色谱图第176-194页
附录E 质谱图第194-208页
附录F 核磁共振谱图第208-222页
作者简历及在学期间所取得的科研成果第222-223页

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