| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-7页 |
| 引言 | 第11-12页 |
| 第一章 文献综述 | 第12-23页 |
| 1.1 植酸 | 第12-13页 |
| 1.1.1 植酸的理化性质 | 第12页 |
| 1.1.2 植酸的分布 | 第12页 |
| 1.1.3 植酸的用途与抗营养化作用 | 第12-13页 |
| 1.2 植酸酶 | 第13-19页 |
| 1.2.1 植酸酶的种类及来源 | 第13-14页 |
| 1.2.2 微生物植酸酶基因结构 | 第14页 |
| 1.2.3 植酸酶分子中的二硫键 | 第14-15页 |
| 1.2.4 植酸酶的高级结构 | 第15页 |
| 1.2.5 植酸酶的催化机理 | 第15-16页 |
| 1.2.6 植酸酶基因工程的研究进展 | 第16-19页 |
| 1.2.6.1 筛选产耐热植酸酶的菌株 | 第16页 |
| 1.2.6.2 植酸酶异源表达 | 第16页 |
| 1.2.6.3 植酸酶分子的糖基化修饰 | 第16-17页 |
| 1.2.6.4 植酸酶分子的定点突变 | 第17页 |
| 1.2.6.5 植酸酶的同序概念 | 第17页 |
| 1.2.6.6 结构延伸突变 | 第17页 |
| 1.2.6.7 植酸酶的定向进化 | 第17-18页 |
| 1.2.6.8 其它因素对植酸酶活性的影响 | 第18-19页 |
| 1.2.7 植酸酶的应用 | 第19页 |
| 1.3 RCR介导的定点突变 | 第19-20页 |
| 1.3.1 重叠延伸PCR | 第19页 |
| 1.3.2 大引物PCR | 第19-20页 |
| 1.3.3 定点突变试剂盒 | 第20页 |
| 1.4 酵母表面展示体系 | 第20-22页 |
| 1.4.1 酵母表面展示的理论基础 | 第20页 |
| 1.4.1.1 酵母表面结构 | 第20页 |
| 1.4.1.2 糖基磷脂酰肌醇（GPI）蛋白 | 第20页 |
| 1.4.2 酵母表面展示体系的类型 | 第20-21页 |
| 1.4.2.1 凝集素系统 | 第20-21页 |
| 1.4.2.2 絮凝素系统 | 第21页 |
| 1.4.3 酵母表面展示的应用 | 第21-22页 |
| 1.4.3.1 酵母表面展示与全细胞催化剂 | 第21页 |
| 1.4.3.2 酵母表面展示与生物吸附 | 第21页 |
| 1.4.3.3 抗原表面展示 | 第21-22页 |
| 1.5 本研究的主要内容和意义 | 第22-23页 |
| 第二章 黑曲霉植酸酶基因的定点突变 | 第23-36页 |
| 2.1 材料 | 第23-24页 |
| 2.1.1 菌株和质粒 | 第23页 |
| 2.1.2 分子生物学试剂 | 第23页 |
| 2.1.3 化学试剂 | 第23-24页 |
| 2.1.4 培养基 | 第24页 |
| 2.2 方法 | 第24-31页 |
| 2.2.1 黑曲霉基因组DNA提取 | 第24页 |
| 2.2.2 引物设计 | 第24-25页 |
| 2.2.3 植酸酶基因phyA的扩增 | 第25-26页 |
| 2.2.4 PCR产物纯化 | 第26页 |
| 2.2.5 大肠杆菌DH5α 感受态细胞的制备 | 第26-27页 |
| 2.2.6 目的片段与T载体连接及转化 | 第27页 |
| 2.2.7 碱裂解法小量提取重组质粒 | 第27-28页 |
| 2.2.8 定点突变质粒制备 | 第28-31页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第31-35页 |
| 2.3.1 黑曲霉基因组DNA的提取 | 第31页 |
| 2.3.2 目的基因扩增 | 第31-32页 |
| 2.3.3 菌液PCR验证 | 第32页 |
| 2.3.4 pMD19T-phyA的测序鉴定 | 第32-33页 |
| 2.3.5 突变位点的引入 | 第33-35页 |
| 2.4 本章小结 | 第35-36页 |
| 第三章 植酸酶表面展示 | 第36-50页 |
| 3.1 材料 | 第36-37页 |
| 3.1.1 菌株和质粒 | 第36页 |
| 3.1.2 分子生物学试剂 | 第36页 |
| 3.1.3 化学试剂 | 第36-37页 |
| 3.1.4 培养基 | 第37页 |
| 3.2 方法 | 第37-43页 |
| 3.2.1 引物设计 | 第37页 |
| 3.2.2 锚定基因fs-Common和植酸酶基因phyA-Commom的扩增 | 第37-38页 |
| 3.2.3 锚定基因fs-Seamless和植酸酶基因phyA-Seamless的扩增 | 第38-39页 |
| 3.2.4 载体pPICZαC双酶切线性化 | 第39页 |
| 3.2.5 胶回收纯化目的片段 | 第39-40页 |
| 3.2.6 无缝克隆操作步骤 | 第40-41页 |
| 3.2.6.1 载体和目的片段的制备 | 第40-41页 |
| 3.2.6.2 克隆反应体系的建立 | 第41页 |
| 3.2.6.3 转化 | 第41页 |
| 3.2.7 Pichia GS115化学感受态的制备及转化 | 第41-43页 |
| 3.2.7.1 感受态细胞制备 | 第41-42页 |
| 3.2.7.2 重组载体线性化 | 第42页 |
| 3.2.7.3 转化 | 第42页 |
| 3.2.7.4 酵母基因组DNA提取 | 第42-43页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第43-49页 |
| 3.3.1 表达载体pPICZαC-FS/phyA示意图 | 第43-44页 |
| 3.3.2 fs-Seamless和phyA-Seamless的扩增 | 第44页 |
| 3.3.3 载体pPICZαC双酶切线性化 | 第44-45页 |
| 3.3.4 表达载体pPICZαC-FS/phyA的测序鉴定 | 第45-47页 |
| 3.3.5 表达载体pPICZαC-FS/phyA线性化 | 第47页 |
| 3.3.6 PCR筛选阳性转化子 | 第47-49页 |
| 3.4 本章小结 | 第49-50页 |
| 第四章 展示酶的酶学性质研究 | 第50-66页 |
| 4.1 材料 | 第50-51页 |
| 4.1.1 菌株 | 第50页 |
| 4.1.2 分子生物学试剂 | 第50页 |
| 4.1.3 化学试剂 | 第50-51页 |
| 4.1.4 培养基 | 第51页 |
| 4.2 方法 | 第51-56页 |
| 4.2.1 重组酵母转化子的诱导表达 | 第51-52页 |
| 4.2.2 展示植酸酶活性的测定 | 第52页 |
| 4.2.3 无机磷标准曲线的绘制 | 第52页 |
| 4.2.4 蛋白质标准曲线的绘制 | 第52-53页 |
| 4.2.5 细胞免疫荧光染色 | 第53-54页 |
| 4.2.6 流式细胞仪检测 | 第54页 |
| 4.2.7 展示植酸酶内源荧光光谱分析 | 第54页 |
| 4.2.8 酵母细胞壁分离 | 第54页 |
| 4.2.9 SDS-PAGE分析 | 第54-55页 |
| 4.2.10 展示植酸酶酶学性质的研究 | 第55-56页 |
| 4.2.10.1 展示植酸酶特征常数Km和kcat测定 | 第55页 |
| 4.2.10.2 展示植酸酶最适温度的测定 | 第55页 |
| 4.2.10.3 展示植酸酶最适pH的测定 | 第55-56页 |
| 4.2.10.4 展示植酸酶热稳定性的测定 | 第56页 |
| 4.2.10.5 展示植酸酶的酸碱耐受性 | 第56页 |
| 4.2.10.6 金属离子对展示植酸酶的影响 | 第56页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第56-65页 |
| 4.3.1 免疫荧光检测 | 第56-57页 |
| 4.3.2 流式细胞仪检测 | 第57-58页 |
| 4.3.3 展示植酸酶内源荧光光谱 | 第58-59页 |
| 4.3.4 SDS-PAGE分析 | 第59页 |
| 4.3.5 展示植酸酶酶活诱导曲线 | 第59-60页 |
| 4.3.6 展示植酸酶基本动力学参数 | 第60-62页 |
| 4.3.7 展示植酸酶反应的最适温度 | 第62页 |
| 4.3.8 展示植酸酶热稳定性 | 第62-63页 |
| 4.3.9 展示植酸酶的反应最适pH | 第63页 |
| 4.3.10 展示植酸酶的酸碱耐受性 | 第63-64页 |
| 4.3.11 金属离子对展示植酸酶的影响 | 第64-65页 |
| 4.4 本章小结 | 第65-66页 |
| 第五章 结论与展望 | 第66-68页 |
| 5.1 全文主要结论 | 第66页 |
| 5.2 创新点 | 第66-67页 |
| 5.3 展望 | 第67-68页 |
| 参考文献 | 第68-74页 |
| 个人简介 | 第74-75页 |
| 致谢 | 第75-76页 |
