| 中文摘要 | 第9-11页 |
| Abstract | 第11-12页 |
| 第一部分 | 第13-99页 |
| 缩略语表 | 第14-16页 |
| 前言 | 第16-22页 |
| 1. 3'UTR参与调控mRNA 3'末端加工 | 第17-18页 |
| 1.1 3'末端加工过程的顺式作用元件 | 第17页 |
| 1.2 mRNA 3'末端加工中的RNA结合蛋白 | 第17页 |
| 1.3 mRNA 3'末端加工过程 | 第17-18页 |
| 2. 3'UTR参与调控mRNA翻译过程 | 第18-19页 |
| 2.1 3'UTR包含参与转录后水平调控的顺式作用元件 | 第18页 |
| 2.2 与3'UTR相互结合的反式作用因子 | 第18-19页 |
| 2.3 3'UTR中顺式作用元件与主要的反式作用因子相互作用调控基因表达 | 第19页 |
| 3. 3'UTR参与调控mRNA翻译过程 | 第19-20页 |
| 4. 3'UTR突变引起的基因表达调控异常与肿瘤发生的关系 | 第20页 |
| 本课题研究目标 | 第20-22页 |
| 材料与方法 | 第22-48页 |
| 1. 实验材料 | 第22-31页 |
| 1.1 细胞株、菌种及质粒 | 第22-23页 |
| 1.2 实验试剂 | 第23-25页 |
| 1.3 主要仪器设备 | 第25-26页 |
| 1.4 引物的合成与设计 | 第26-27页 |
| 1.5 siRNAs | 第27页 |
| 1.6 常用试剂的配制 | 第27-31页 |
| 2. 研究方法 | 第31-48页 |
| 2.1 对细胞的处理 | 第31页 |
| 2.2 细胞瞬时转染 | 第31-32页 |
| 2.3 构建稳定高表达细胞系 | 第32-33页 |
| 2.4 细胞总DNA和总RNA的提取 | 第33页 |
| 2.5 RT-PCR | 第33-35页 |
| 2.6 细胞总蛋白的提取 | 第35页 |
| 2.7 蛋白浓度的测定 | 第35-36页 |
| 2.8 Western Blotting | 第36-37页 |
| 2.9 质粒转化 | 第37页 |
| 2.10 质粒提取及鉴定 | 第37-38页 |
| 2.11 胶回收纯化 | 第38页 |
| 2.12 RNA体外转录及纯化 | 第38-41页 |
| 2.13 Biotin-RNA pull-down试验 | 第41-42页 |
| 2.14 RNA结合蛋白免疫沉淀实验(RNA-binding protein immunoprecipitation,RIP) | 第42-44页 |
| 2.15 细胞增殖实验 | 第44页 |
| 2.16 细胞克隆形成实验 | 第44页 |
| 2.17 细胞迁移和侵袭实验(Transwell assay) | 第44-45页 |
| 2.18 裸鼠移植瘤实验 | 第45页 |
| 2.19 裸鼠肺转移模型 | 第45-46页 |
| 2.20 免疫共沉淀(Immunoprecipitation,IP)试验 | 第46页 |
| 2.21 免疫荧光(Immunofluoresence,IF) | 第46页 |
| 2.22 统计学分析 | 第46-48页 |
| 实验结果 | 第48-84页 |
| 1. CAPZA1在食管鳞癌(ESCC)中存在拷贝数缺失和位点突变 | 第48-49页 |
| 2. CAPZA1在食管鳞癌细胞中的表达 | 第49-51页 |
| 3. 野生型CAPZA1抑制细胞生长增殖,突变可以减弱这种抑制功能 | 第51-54页 |
| 4. CAPZA1 3'UTR突变后促进食管癌细胞侵袭、迁移能力 | 第54-55页 |
| 5. 野生型CAPZA1明显抑制KYSE510细胞裸鼠体内生长能力,CAPZA1 3'UTR突变后这种抑制作用明显减弱 | 第55-57页 |
| 6. 敲降CAPZA1后促进其生长增殖能力 | 第57-59页 |
| 7. CAPZA1敲降后减弱其抑制转移的能力 | 第59-61页 |
| 8. CAPZA1 mRNA二级结构预测 | 第61-62页 |
| 9. Biotin-RNA pull-down试验寻找CAPZA1相互作用蛋白 | 第62-69页 |
| 9.1 质粒构建及验证 | 第62-63页 |
| 9.2 体外转录 | 第63-64页 |
| 9.3 Biotin-RNA pull-down试验以及结合蛋白的质谱鉴定 | 第64-68页 |
| 9.4 RNA结合蛋白质免疫沉淀(RIP)验证hnRNPK和PTBP1蛋白与野生型CAPZA13'UTR特异性结合 | 第68-69页 |
| 10. CAPZA1突变对其mRNA稳定性的影响 | 第69-71页 |
| 11. 野生型中敲降hnRNPK和PTBP1后,CAPZA1 mRNA稳定性明显下降 | 第71-72页 |
| 12. 突变型中敲降UPF1后CAPZA1 mRNA稳定性明显上升 | 第72-74页 |
| 13. 敲降hnRNP K和PTBP1可以明显促进食管鳞癌细胞生长增殖能力 | 第74-76页 |
| 14. 敲降hnRNP K和PTBP1可以明显促进食管鳞癌细胞迁移和侵袭能力 | 第76-77页 |
| 15. 敲降UPF1可以明显减弱食管鳞癌细胞生长增殖能力 | 第77-79页 |
| 16. 敲降UPF1可以明显减弱食管鳞癌细胞迁移和侵袭能力 | 第79-80页 |
| 17. 免疫共沉淀(IP)试验验证hnRNP K、PTBP1与UPF1三个蛋白之间的相互作用 | 第80-84页 |
| 17.1 免疫共沉淀(IP)试验验证hnRNP K与UPF1蛋白之间的关系 | 第80-81页 |
| 17.2 免疫共沉淀(IP)试验研究PTBP1与UPF1蛋白之间的相互作用 | 第81页 |
| 17.3 免疫共沉淀(IP)试验分析PTBP1与hnRNP K蛋白之间的关系 | 第81-82页 |
| 17.4 Capza1蛋白在ESCC病人中的细胞浆和细胞核的表达水平 | 第82-84页 |
| 讨论 | 第84-91页 |
| 1. CAPZA1在食管鳞癌(ESCC)中存在拷贝数缺失和位点突变 | 第84-85页 |
| 2. 生物学功能研究发现野生型CAPZA1及突变型CAPZA1对ESCC细胞恶性表型的影响 | 第85页 |
| 3. 分子机制研究发现CAPZA1通过与hnRNP K、PTBP1和UPF1蛋白相互作用来调控自身mRNA稳定性 | 第85-88页 |
| 4. 分子机制研究发现hnRNP K、PTBP1和UPF1蛋白三者之间存在相互作用 | 第88-91页 |
| 结论 | 第91-92页 |
| 参考文献 | 第92-99页 |
| 第二部分 | 第99-166页 |
| 缩略语表 | 第100-102页 |
| 前言 | 第102-105页 |
| 本课题研究目标 | 第103-105页 |
| 材料与方法 | 第105-133页 |
| 1. 实验材料 | 第105-113页 |
| 1.1 细胞株、菌种及质粒 | 第105页 |
| 1.2 实验试剂 | 第105-107页 |
| 1.3 主要仪器设备 | 第107-109页 |
| 1.4 引物的合成与设计 | 第109页 |
| 1.5 siRNAs | 第109-110页 |
| 1.6 常用试剂的配制 | 第110-113页 |
| 2. 研究方法 | 第113-133页 |
| 2.1 细胞处理 | 第113-114页 |
| 2.2 细胞瞬时质粒瞬时转染(以60mm的培养皿为例) | 第114页 |
| 2.3 细胞总RNA的提取(以10mm培养皿为例) | 第114页 |
| 2.4 RT-PCR | 第114-116页 |
| 2.5 细胞总蛋白的提取 | 第116页 |
| 2.6 蛋白浓度的测定 | 第116-117页 |
| 2.7 Western Blotting | 第117-118页 |
| 2.8 感受态细胞的制备 | 第118页 |
| 2.9 质粒提取及鉴定 | 第118-119页 |
| 2.10 胶回收纯化 | 第119页 |
| 2.11 RNA体外转录及纯化 | 第119-122页 |
| 2.12 Biotin-RNA pull-down试验 | 第122-123页 |
| 2.13 RNA结合蛋白免疫沉淀实验(RNA-binding protein immunoprecipitation,RIP) | 第123-125页 |
| 2.14 细胞增殖实验 | 第125页 |
| 2.15 细胞克隆形成实验 | 第125页 |
| 2.16 细胞迁移和侵袭实验(Transwel assay) | 第125-126页 |
| 2.17 凋亡细胞的Annexin V/PI双染 | 第126页 |
| 2.18 RACE PCR实验 | 第126-130页 |
| 2.19 Northern blotting | 第130-132页 |
| 2.20 统计学分析 | 第132-133页 |
| 实验结果 | 第133-155页 |
| 1. RACE PCR检测CAPZA1 3'UTR单独转录 | 第133-134页 |
| 2. Northern blot验证CAPZA1 3'UTR单独存在及其在食管癌细胞系中的表达 | 第134-135页 |
| 3. 野生型及突变型3'UTR的翻译能力预测 | 第135页 |
| 4. 野生型及突变型3'UTR转录本的RNA二级结构预测 | 第135-136页 |
| 5. CAPZA1与3'UTR的表达互相不影响 | 第136-137页 |
| 6. 单独高表达3'UTR抑制UV诱导的细胞凋亡 | 第137-138页 |
| 7. 单独高表达野生型3'UTR促进细胞生长增殖,克隆形成能力 | 第138-140页 |
| 8. 单独高表达野生型3'UTR促进细胞迁移和侵袭能力 | 第140-142页 |
| 9. Biotin-RNA pulldown试验寻找CAPZA1 3'UTR相互作用蛋白 | 第142-147页 |
| 9.1 体外转录 | 第142-143页 |
| 9.2 Biotin-RNA pull-down试验以及结合蛋白的质谱鉴定 | 第143-147页 |
| 10. RNA结合蛋白质免疫沉淀(RIP)验证IGF2BP3、IGF2BP2和IGF2BP1蛋白与野生型3'UTR特异性结合 | 第147-149页 |
| 11. 3'UTR单独发挥促癌功能的分子机制 | 第149-150页 |
| 12. 敲降IGF2BP3可以明显减弱高表达野生型3'UTR细胞的生长增殖能力 | 第150-153页 |
| 13. 敲降IGF2BP3可以明显减弱高表达野生型3'UTR细胞的迁移和侵袭能力 | 第153-155页 |
| 讨论 | 第155-161页 |
| 1. RACE PCR和northern blot实验检测CAPZA1 3'UTR单独转录 | 第155页 |
| 2. 野生型及突变型3'UTR的翻译能力和二级结构的预测 | 第155-156页 |
| 3. 生物学功能研究发现野生型3'UTR及突变型3'UTR对ESCC细胞恶性表型的影响 | 第156页 |
| 4. 分子机制研究发现3'UTR通过与IGF2BP3、IGF2BP2和IGF2BP1蛋白相互作用来发挥促进ESCC恶性表型的功能 | 第156-160页 |
| 5. 展望 | 第160-161页 |
| 结论 | 第161-162页 |
| 参考文献 | 第162-166页 |
| 基金资助 | 第166-167页 |
| 在读期间发表论文 | 第167-168页 |
| 文献综述 | 第168-179页 |
| Reference | 第176-179页 |
| 致谢 | 第179-181页 |
