| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-8页 |
| 1 引言 | 第8-19页 |
| ·PRRS的病原学 | 第8-12页 |
| ·PRRSV流行病学与发病机制 | 第12-13页 |
| ·PRRSV的免疫学特性 | 第13-14页 |
| ·PRRSV的研究热点及进展 | 第14-15页 |
| ·高致病性PRRS的研究概况 | 第15-19页 |
| 2 材料 | 第19-24页 |
| ·病料 | 第19页 |
| ·细胞、菌种与质粒载体 | 第19页 |
| ·试验所需主要试剂 | 第19-20页 |
| ·主要仪器 | 第20-21页 |
| ·试验所需主要溶液及其配制 | 第21-24页 |
| ·RNA提取所用溶液 | 第21页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳所用溶液 | 第21-22页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备及转化所用试剂 | 第22页 |
| ·SDS-PAGE所用溶液的配制 | 第22页 |
| ·Western-blotting试剂配制 | 第22-24页 |
| 3 方法 | 第24-34页 |
| ·病毒的分离 | 第24页 |
| ·引物设计与合成 | 第24页 |
| ·病毒基因组的提取 | 第24页 |
| ·反转录合成cDNA | 第24-25页 |
| ·PCR扩增完整的PRRSV ORF5基因 | 第25页 |
| ·PCR产物的凝胶回收纯化 | 第25-26页 |
| ·PCR产物的克隆 | 第26-28页 |
| ·目的片段与pGM-T载体的连接 | 第27页 |
| ·Top10感受态细胞的制备 | 第27页 |
| ·转化平板的制备 | 第27页 |
| ·连接产物转化Top10感受态细胞 | 第27-28页 |
| ·重组克隆载体的鉴定 | 第28-29页 |
| ·重组质粒的提取 | 第28页 |
| ·PCR方法筛选阳性克隆 | 第28-29页 |
| ·目的基因的序列测定及序列分析 | 第29页 |
| ·目的基因原核表达载体的构建 | 第29-31页 |
| ·引物设计与合成 | 第29页 |
| ·PCR扩增PRRSV dORF5基因 | 第29页 |
| ·双酶切及连接 | 第29-31页 |
| ·阳性克隆的筛选及鉴定 | 第31页 |
| ·dORF5基因的表达 | 第31-33页 |
| ·重组质粒pGEX-dORF5转化表达菌株R-DE3 | 第31页 |
| ·R-DE3溶原菌的诱导表达 | 第31-32页 |
| ·表达蛋白的SDS-PAGE分析 | 第32页 |
| ·兔抗PRRSV HB-3(cz)株高免血清的制备 | 第32-33页 |
| ·Western-blotting检测表达产物 | 第33页 |
| ·重组蛋白表达条件的优化 | 第33-34页 |
| 4 结果与分析 | 第34-45页 |
| ·病毒分离 | 第34页 |
| ·PRRSV GP5基因的PCR扩增 | 第34-35页 |
| ·PCR方法鉴定阳性克隆 | 第35页 |
| ·阳性克隆质粒序列测定结果 | 第35-36页 |
| ·HB-3(cz)株GP5基因与国内外分离株的同源性分析 | 第36-38页 |
| ·HB-3(cz)株GP5基因与国内外分离株的进化树分析 | 第38-39页 |
| ·GP5蛋白的疏水性分析 | 第39页 |
| ·GP5蛋白抗原表位比较 | 第39-40页 |
| ·跨膜区预测 | 第40页 |
| ·信号肽预测 | 第40页 |
| ·PRRSV dORF5基因的扩增 | 第40-41页 |
| ·重组表达质粒的酶切鉴定 | 第41页 |
| ·重组蛋白的表达 | 第41-42页 |
| ·Western-blotting鉴定分析 | 第42-43页 |
| ·不同诱导时间对重组蛋白表达量的影响 | 第43页 |
| ·不同诱导温度对重组蛋白表达量的影响 | 第43-44页 |
| ·不同IPTG浓度对重组蛋白表达量的影响 | 第44-45页 |
| 5 讨论 | 第45-48页 |
| ·病毒的分离 | 第45页 |
| ·RT-PCR扩增ORF5基因及其在临床组织样品检测上应用探讨 | 第45页 |
| ·ORF5序列分析 | 第45-46页 |
| ·疏水性、抗原性、跨膜区及信号肽分析 | 第46-47页 |
| ·GP5蛋白的原核表达 | 第47-48页 |
| 6 结论 | 第48-49页 |
| 参考文献 | 第49-57页 |
| 在读期间发表论文 | 第57-58页 |
| 作者简介 | 第58-59页 |
| 致谢 | 第59页 |
