| 摘要 | 第1-10页 |
| ABSTRACT | 第10-14页 |
| 缩略语表(Abbreviation) | 第14-16页 |
| 第1章 文献综述 | 第16-49页 |
| ·猪圆环病毒国内外研究概况 | 第16-22页 |
| ·病毒的发现 | 第17页 |
| ·病毒的分类地位 | 第17-18页 |
| ·病毒的病原特征 | 第18-19页 |
| ·PCV基因组结构 | 第19页 |
| ·ORF1基因研究进展 | 第19-20页 |
| ·ORF2基因的研究进展 | 第20-21页 |
| ·ORF3基因研究进展 | 第21-22页 |
| ·猪圆环病毒的致病机理 | 第22-27页 |
| ·免疫刺激 | 第23-24页 |
| ·免疫抑制 | 第24-27页 |
| ·PCV的流行病学 | 第27-31页 |
| ·PCV的宿主 | 第27-28页 |
| ·PCV的传播途径 | 第28页 |
| ·PCV的传播特点 | 第28-30页 |
| ·PCV的分子流行病学研究 | 第30-31页 |
| ·与PCV有关的疾病 | 第31-36页 |
| ·断奶仔猪多系统衰竭综合症 | 第31-34页 |
| ·猪皮炎与肾病综合症 | 第34页 |
| ·母猪繁殖障碍 | 第34-35页 |
| ·猪呼吸道疾病综合征 | 第35页 |
| ·增生性坏死性肺炎 | 第35页 |
| ·先天性震颤 | 第35-36页 |
| ·诊断方法研究 | 第36-39页 |
| ·病原学方法 | 第36-38页 |
| ·血清学方法 | 第38-39页 |
| ·PCV2相关疾病的防制 | 第39-40页 |
| ·PCV2相关疾病的疫苗研究 | 第40-41页 |
| ·PMWS动物模型的研究 | 第41-44页 |
| ·PCV2单独感染动物模型的建立 | 第41-42页 |
| ·以PCV2感染性克隆接种后复制PMWS的情况 | 第42页 |
| ·PCV2联合PPV,PRRSV或猪肺炎支原体感染后复制PMWS的情况 | 第42-44页 |
| ·PCV2感染小动物模型的建立 | 第44页 |
| ·潜在的公共卫生学意义 | 第44-45页 |
| ·杆状病毒简介 | 第45-49页 |
| ·杆状病毒表达系统的研究 | 第45-47页 |
| ·杆状病毒表达系统安全性高 | 第45页 |
| ·昆虫杆状病毒表达系统目的基因容量大 | 第45-46页 |
| ·杆状病毒表达系统蛋白表达效率高 | 第46页 |
| ·杆状病毒表达系统具有翻译后修饰系统 | 第46页 |
| ·杆状病毒表达系统操作简单 | 第46-47页 |
| ·杆状病毒作为哺乳动物细胞表达载体的研究 | 第47页 |
| ·杆状病毒作为哺乳动物细胞表达载体在疫苗研究中的应用 | 第47-49页 |
| 第2章 研究目的与意义 | 第49-50页 |
| 第3章 材料与方法 | 第50-71页 |
| ·试验材料 | 第50-56页 |
| ·毒株与细胞 | 第50页 |
| ·菌种与质粒 | 第50-52页 |
| ·主要药品及试剂 | 第52-53页 |
| ·培养基与抗生素及其配制 | 第53页 |
| ·血清 | 第53-54页 |
| ·缓冲液 | 第54-56页 |
| ·实验动物 | 第56页 |
| ·实验方法 | 第56-71页 |
| ·病毒的增殖 | 第56页 |
| ·限制性内切酶酶切反应 | 第56页 |
| ·PCR产物或酶切产物的电泳检测 | 第56-57页 |
| ·PCR产物或酶切产物回收与纯化 | 第57页 |
| ·外源DNA片段与质粒载体的连接反应 | 第57-58页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法) | 第58页 |
| ·连接产物的转化 | 第58页 |
| ·质粒的制备与鉴定 | 第58-60页 |
| ·质粒转染(脂质体介导转染法) | 第60-61页 |
| ·构建重组杆状病毒的操作流程及示意图 | 第61-62页 |
| ·重组穿梭载体(Bacmid)的构建 | 第62页 |
| ·重组穿梭载体(Bacmid)的提取 | 第62-63页 |
| ·重组杆状病毒获得 | 第63页 |
| ·重组杆状病毒转导PK-15细胞 | 第63页 |
| ·间接免疫荧光试验(IFA)检测目的蛋白的体外表达 | 第63页 |
| ·Western blotting检测目的蛋白在真核细胞中的表达 | 第63-65页 |
| ·病毒粒子的电镜观察 | 第65页 |
| ·ORF2-ELISA试验 | 第65页 |
| ·半数细胞培养物感染量(TCID_(50))的测定 | 第65-66页 |
| ·微量中和试验(固定病毒-稀释血清法) | 第66页 |
| ·细胞免疫的检测 | 第66-69页 |
| ·动物试验 | 第69-70页 |
| ·统计学方法 | 第70-71页 |
| 第4章 结果和分析 | 第71-102页 |
| ·表达猪圆环病毒2型ORF2蛋白的重组杆状病毒Ac-ORF2的构建 | 第71-75页 |
| ·PCV2 ORF2基因的PCR扩增 | 第71页 |
| ·转移载体pFast-ORF2的构建 | 第71-72页 |
| ·重组穿梭载体(rBac.ORF2)的构建 | 第72-73页 |
| ·重组杆状病毒Ac-ORF2的获得 | 第73页 |
| ·Ac-ORF2表达外源蛋白的Western-blotting分析 | 第73-74页 |
| ·电镜观察 | 第74-75页 |
| ·ORF2亚单位疫苗免疫原性的研究 | 第75-76页 |
| ·免疫仔猪的ELISA抗体水平 | 第75页 |
| ·免疫仔猪诱导的T细胞增殖反应 | 第75-76页 |
| ·ORF2基因的修饰及其免疫原性的研究 | 第76-87页 |
| ·表达PCV2核定位型ORF2蛋白的重组质粒构建 | 第76-77页 |
| ·表达PCV2胞浆定位型ORF2蛋白的重组质粒构建 | 第77-78页 |
| ·表达PCV2分泌型ORF2蛋白的重组质粒构建 | 第78-80页 |
| ·表达PCV2膜结合型ORF2蛋白的重组质粒构建 | 第80-81页 |
| ·间接免疫荧光检测修饰的ORF2基因的表达 | 第81-82页 |
| ·免疫小鼠的ELISA抗体水平 | 第82-83页 |
| ·免疫小鼠的中和抗体水平检测 | 第83-84页 |
| ·免疫小鼠淋巴细胞增殖检测 | 第84-85页 |
| ·ELISPOT检测免疫小鼠脾细胞分泌IFN-γ的CD8~+T淋巴细胞数目 | 第85-87页 |
| ·实时荧光定量PCR检测免疫小鼠脾细胞中IFN-γ mRNA表达 | 第87页 |
| ·杆状病毒介导的表达PCV2 OFR2的重组毒疫苗的构建以及免疫原性的研究 | 第87-102页 |
| ·水泡性口炎病毒VSV-G基因的PCR扩增 | 第87-88页 |
| ·转移载体pFast-VSVG的构建 | 第88页 |
| ·转移载体pFast-VSVG-CMV-ORF2的构建 | 第88-90页 |
| ·转移载体pFast-VSVG-CMV-EGFP的构建 | 第90页 |
| ·重组穿梭载体的构建 | 第90页 |
| ·重组杆状病毒Ac-V-ORF2、Ac-V-EGFP的获得 | 第90-91页 |
| ·重组杆状病毒Ac-V-EGFP感染sf9昆虫细胞 | 第91-92页 |
| ·重组病毒Ac-V-EGFP高效转导哺乳动物细胞 | 第92-94页 |
| ·重组病毒Ac-V-ORF2转导哺乳动物细胞 | 第94-96页 |
| ·重组病毒的纯化与毒价测定 | 第96页 |
| ·免疫小鼠的ELISA抗体水平 | 第96-97页 |
| ·免疫小鼠的中和抗体水平 | 第97-98页 |
| ·免疫小鼠淋巴细胞增殖检测 | 第98-100页 |
| ·免疫小鼠脾细胞分泌的IFN-γ水平分析 | 第100页 |
| ·FACS分析免疫小鼠脾细胞内的IFN-γ水平 | 第100-101页 |
| ·实时荧光定量PCR检测免疫小鼠脾细胞中IFN-γ mRNA表达 | 第101-102页 |
| 第5章 讨论与结论 | 第102-115页 |
| ·讨论 | 第102-113页 |
| ·PCV2 ORF2蛋白病毒样颗粒的形成 | 第102-103页 |
| ·病毒样颗粒蛋白ORF2的免疫原性研究 | 第103-104页 |
| ·病毒样颗粒疫苗的应用前景 | 第104-105页 |
| ·PCV2 ORF2基因的修饰 | 第105-107页 |
| ·修饰的ORF2基因的免疫原性研究 | 第107-109页 |
| ·VSV-G修饰的重组杆状病毒的构建 | 第109-110页 |
| ·杆状病毒转导哺乳动物细胞的方法 | 第110页 |
| ·杆状病毒介导外源基因在哺乳动物细胞中的表达 | 第110-111页 |
| ·杆状病毒转导哺乳动物细胞可能机制 | 第111页 |
| ·重组杆状病毒诱导的免疫应答 | 第111-113页 |
| ·后续研究工作 | 第113页 |
| ·结论 | 第113-115页 |
| 参考文献 | 第115-132页 |
| 致谢 | 第132-133页 |
| 附录 | 第133-134页 |
