卤醇脱卤酶HheC的改造及其在手性药物合成中的应用
| 摘要 | 第1-5页 |
| ABSTRACT | 第5-7页 |
| 缩略语 | 第7-8页 |
| 氨基酸的缩写 | 第8-12页 |
| 第一章 绪论 | 第12-23页 |
| ·卤醇脱卤酶的应用研究 | 第13-16页 |
| ·卤醇脱卤酶催化的邻卤醇的脱卤反应 | 第13-14页 |
| ·亲核试剂介导的环氧化物的开环反应 | 第14-15页 |
| ·三类卤醇脱卤酶的实际应用 | 第15-16页 |
| ·卤醇脱卤酶的改造 | 第16-18页 |
| ·论文研究内容 | 第18-23页 |
| ·基于大引物的随机突变文库的构建 | 第18-19页 |
| ·卤醇脱卤酶HheC 活性位点构象变化的研究 | 第19-20页 |
| ·卤醇脱卤酶HheC 立体选择性的逆转 | 第20-21页 |
| ·卤醇脱卤酶HheC 卤素结合位点的研究 | 第21-23页 |
| 第二章 基于大引物的突变文库的构建 | 第23-32页 |
| ·材料和方法 | 第24-26页 |
| ·突变 | 第24-25页 |
| ·基于正交优化设计的大引物PCR 用于文库的构建 | 第25页 |
| ·正交优化设计 | 第25-26页 |
| ·多位点饱和突变文库质量的评价 | 第26页 |
| ·实验结果 | 第26-29页 |
| ·HheC 基因四个位点的随机突变 | 第26-27页 |
| ·HheC 基因非邻近位点的饱和突变 | 第27-28页 |
| ·突变文库质量的评价 | 第28-29页 |
| ·讨论 | 第29-30页 |
| ·补充材料基于大引物的易错PCR | 第30-32页 |
| 第三章 HheC 活性位点构象变化的研究 | 第32-47页 |
| ·实验材料与方法 | 第33-36页 |
| ·材料 | 第33-34页 |
| ·突变文库的构建 | 第34页 |
| ·文库的筛选 | 第34页 |
| ·酶的纯化及活性测定 | 第34-35页 |
| ·稳态动力学测定 | 第35页 |
| ·HheC 的分子对接 | 第35-36页 |
| ·HheC 的荧光测量 | 第36页 |
| ·实验结果 | 第36-41页 |
| ·文库的筛选及突变体的纯化 | 第36-37页 |
| ·突变体的动力学特性 | 第37-39页 |
| ·突变体的稳态底物结合 | 第39页 |
| ·突变体活性位点分子对接结果分析 | 第39-41页 |
| ·讨论 | 第41-43页 |
| ·催化活性的多重相加效应分析 | 第41-43页 |
| ·突变体Km 的多重效应 | 第43页 |
| ·结论 | 第43-44页 |
| ·补充材料 | 第44-47页 |
| 第四章 HheC 立体选择性的逆转 | 第47-57页 |
| ·实验材料与方法 | 第48-50页 |
| ·实验材料 | 第48页 |
| ·立体选择性突变文库的构建 | 第48页 |
| ·高通量筛选 | 第48-49页 |
| ·酶的纯化，活性测定，动力学测定 | 第49页 |
| ·酶催化的S-ECHB 向HN 的转化 | 第49页 |
| ·突变体的立体选择性的手性测定 | 第49-50页 |
| ·实验结果 | 第50-54页 |
| ·立体选择性突变位点的选择 | 第50-51页 |
| ·T134 和W139 位点的饱和突变 | 第51-52页 |
| ·HheC 立体选择性的逆转 | 第52-53页 |
| ·HheC 突变体的动力学参数及立体选择性 | 第53-54页 |
| ·讨论与总结 | 第54-56页 |
| ·补充材料 | 第56-57页 |
| 第五章 HheC 卤素结合位点的研究 | 第57-67页 |
| ·实验材料与方法 | 第58-60页 |
| ·实验材料 | 第58页 |
| ·CASTing 文库的构建 | 第58-59页 |
| ·CASTing 文库的筛选 | 第59页 |
| ·突变体的纯化，稳态动力学参数 | 第59页 |
| ·环氧化合物的动力学拆分 | 第59页 |
| ·突变体的热稳定性 | 第59-60页 |
| ·结果与讨论 | 第60-66页 |
| ·文库的筛选及突变体的动力学参数 | 第60-61页 |
| ·突变体的热稳定性 | 第61页 |
| ·外消旋底物对硝-2-氯-1-苯乙醇的动力学拆分 | 第61-63页 |
| ·单取代脂肪族环氧化合物的开环反应 | 第63-65页 |
| ·结论 | 第65-66页 |
| ·补充材料 | 第66-67页 |
| 第六章 展望 | 第67-73页 |
| ·卤醇脱卤酶开环反应的高通量筛选 | 第67-68页 |
| ·卤醇脱卤酶卤离子释放通道的研究 | 第68-69页 |
| ·卤醇脱卤酶HheC 的C-末端的功能研究 | 第69页 |
| ·在卤醇脱卤酶的结构中设计短链脱氢还原酶的活性 | 第69-70页 |
| ·卤醇脱卤酶的荧光淬灭 | 第70-72页 |
| ·卤醇脱卤酶卤素结合位点氨基酸的删除 | 第72-73页 |
| 致谢 | 第73-74页 |
| 参考文献 | 第74-90页 |
| 攻硕期间的研究成果 | 第90-91页 |
