| 摘要 | 第1-8页 |
| ABSTRACT | 第8-9页 |
| 英文缩略词表 | 第9-10页 |
| 第一章 前言 | 第10-25页 |
| ·哺乳动物细胞表达系统概述 | 第10-16页 |
| ·哺乳动物细胞表达系统的特点 | 第10-11页 |
| ·影响外源基因在哺乳动物细胞表达效率的因素 | 第11-15页 |
| ·基因拷贝数和整合位点 | 第11-12页 |
| ·转录水平 | 第12-13页 |
| ·翻译水平 | 第13-15页 |
| ·哺乳动物细胞表达生物技术药物的国内外研究概况 | 第15页 |
| ·大规模动物细胞培养技术简介 | 第15-16页 |
| ·表皮生长因子受体(EGFR)概述 | 第16-20页 |
| ·EGFR简介 | 第16页 |
| ·EGFR的结构特性 | 第16-18页 |
| ·表达截短型 EGFR(sEGFR501)的理由 | 第18-20页 |
| ·增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的简介 | 第20页 |
| ·BelloCell~(?)高密度细胞培养体系 | 第20-22页 |
| ·组成部分 | 第20-21页 |
| ·工作原理 | 第21页 |
| ·BioNOC II~(?)高密度细胞培养微载体 | 第21-22页 |
| ·本研究的主要任务和设计思路 | 第22-25页 |
| ·主要任务 | 第22页 |
| ·设计思路 | 第22-25页 |
| ·宿主细胞的选择 | 第23页 |
| ·表达载体的确定 | 第23-24页 |
| ·转染方法的选择 | 第24-25页 |
| 第二章 实验材料和方法 | 第25-36页 |
| ·主要仪器 | 第25-26页 |
| ·实验材料 | 第26-29页 |
| ·细胞株和质粒 | 第26页 |
| ·工具酶和试剂盒 | 第26页 |
| ·常用试剂及配方 | 第26-29页 |
| ·实验方法 | 第29-36页 |
| ·基因工程技术 | 第29-33页 |
| ·试剂盒小量抽提质粒 | 第29页 |
| ·DNA的酶切、连接、转化 | 第29-30页 |
| ·转化子的鉴定 | 第30页 |
| ·试剂盒大量抽提质粒 | 第30-31页 |
| ·RT-PCR | 第31-32页 |
| ·双抗夹心 ELISA检测法 | 第32-33页 |
| ·细胞培养技术 | 第33-36页 |
| ·细胞计数 | 第33-34页 |
| ·细胞冷冻保存 | 第34页 |
| ·细胞的复苏 | 第34页 |
| ·磷酸钙共沉淀转染方法 | 第34-35页 |
| ·脂质体转染方法 | 第35-36页 |
| 第三章 sEGFR501/COS7瞬时表达系统的建立及 COS7大规模培养的初步研究 | 第36-51页 |
| ·EGFP磷酸钙共沉淀转染 COS7条件的确定 | 第36-42页 |
| ·pcDNA3.1-EGFP质粒的构建 | 第36-38页 |
| ·增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)引物设计 | 第36-37页 |
| ·EGFP基因的扩增 | 第37页 |
| ·pcDNA3.1-EGFP质粒的鉴定 | 第37-38页 |
| ·EGFP磷酸钙共沉淀转染 COS7各参数的优化 | 第38-42页 |
| ·反应时间和温度 | 第38-39页 |
| ·DNA剂量 | 第39页 |
| ·细胞接种密度 | 第39-42页 |
| ·COS7瞬时表达外源蛋白的周期实验 | 第42页 |
| ·瞬时表达规模逐步放大 | 第42页 |
| ·sEGFR501在 COS7中表达 | 第42-46页 |
| ·pcDNA3.1-sEGFR501质粒的构建 | 第42-44页 |
| ·sEGFR501引物设计 | 第42页 |
| ·sEGFR501基因扩增 | 第42页 |
| ·pcDNA3.1-sEGFR501质粒的鉴定 | 第42-44页 |
| ·COS7瞬时表达sEGFR501的检测 | 第44-46页 |
| ·RNA水平检测 | 第44-45页 |
| ·蛋白水平检测 | 第45-46页 |
| ·COS7大规模培养条件的摸索 | 第46-49页 |
| ·普通培养 COS7的生长曲线 | 第46-47页 |
| ·BelloCell~(?)生物反应器培养COS7的条件摸索 | 第47-49页 |
| ·本章小结 | 第49-51页 |
| 第四章 sEGFR501/ CHO-K1稳定表达系统的建立 | 第51-63页 |
| ·EGFP脂质体转染 CHO-K1条件的确定 | 第51-54页 |
| ·pIRESegfp质粒的构建 | 第51-52页 |
| ·pIRESegfp质粒的引物序列 | 第52页 |
| ·pIRESegfp质粒的鉴定 | 第52页 |
| ·EGFP脂质体转染 CHO-K1实验条件的优化 | 第52-54页 |
| ·sEGFR501在 CHO-K1中表达 | 第54-60页 |
| ·pIRESneo-sEGFR501质粒构建 | 第54-55页 |
| ·引物序列 | 第54-55页 |
| ·pIRESneo-sEGFR501质粒的鉴定 | 第55页 |
| ·G418筛选浓度的确定 | 第55-56页 |
| ·工程细胞株的筛选 | 第56-58页 |
| ·CHO-K1稳定表达sEGFR501的检测 | 第58-60页 |
| ·蛋白水平的检测 | 第58-59页 |
| ·RNA水平的检测 | 第59-60页 |
| ·传代稳定性实验 | 第60页 |
| ·流式细胞仪高通量筛选稳定表达细胞株方法的建立 | 第60-62页 |
| ·pIRESegfp-sEGFR501质粒的构建 | 第60-61页 |
| ·引物序列 | 第60-61页 |
| ·pIRESegfp-sEGFR501质粒鉴定 | 第61页 |
| ·荧光激发细胞分选(FACS) | 第61-62页 |
| ·本章小结 | 第62-63页 |
| 第五章 讨论 | 第63-73页 |
| ·瞬时表达系统的讨论 | 第63-65页 |
| ·sEGFR501/COS7瞬时表达系统 | 第63页 |
| ·磷酸钙共沉淀转染的实验参数 | 第63-64页 |
| ·瞬时表达系统的潜在应用前景 | 第64-65页 |
| ·稳定表达系统的讨论 | 第65-68页 |
| ·sEGFR501/CHO-K1稳定表达系统 | 第65-66页 |
| ·阳离子脂质体转染的实验参数 | 第66页 |
| ·快速筛选高效稳定细胞株的策略 | 第66-68页 |
| ·采用双顺反子表达载体 | 第67页 |
| ·荧光激发分选与双顺反子结合建立高通量筛选方法 | 第67-68页 |
| ·sEGFR501表达量不够理想的原因分析及解决方案 | 第68-69页 |
| ·大规模培养细胞需注意的几个问题 | 第69-71页 |
| ·生物反应器 | 第69-70页 |
| ·培养基 | 第70页 |
| ·过程监控 | 第70-71页 |
| ·其它 | 第71-73页 |
| ·磷酸钙共沉淀转染试剂的配制和 DNA质量 | 第71页 |
| ·COS7瞬时表达周期短 | 第71-72页 |
| ·传代稳定性实验的结果分析 | 第72页 |
| ·目的蛋白表达的检测 | 第72-73页 |
| 第六章 总结与展望 | 第73-75页 |
| ·总结 | 第73页 |
| ·展望 | 第73-75页 |
| 参考文献 | 第75-80页 |
| 附录 | 第80-85页 |
| 附录1 pcNDA3.1-sEGFR501测序图 | 第80-81页 |
| 附录2 pIRESegfp测序图 | 第81-82页 |
| 附录3 BIOPROFILE250对 COS7大规模培养的过程监控 | 第82-84页 |
| 附录4 攻读硕士学位期间发表的论文 | 第84-85页 |
| 致谢 | 第85页 |
