| 摘要 | 第1-4页 |
| Abstract | 第4-14页 |
| 第一章 前言 | 第14-34页 |
| ·海洋放线菌概述 | 第14-19页 |
| ·海洋放线菌的多样性 | 第14-15页 |
| ·海洋放线菌次级代谢产物 | 第15-18页 |
| ·抗生素 | 第15-16页 |
| ·抗肿瘤化合物 | 第16-17页 |
| ·抗菌活性物质 | 第17页 |
| ·作用于遗传物质的化合物 | 第17页 |
| ·酶抑制剂 | 第17-18页 |
| ·其他活性化合物 | 第18页 |
| ·海洋放线菌中结构新颖的次级代谢产物 | 第18-19页 |
| ·聚酮类化合物的生物合成机制及组合生物合成 | 第19-29页 |
| ·聚酮类化合物的生物合成机制 | 第19-21页 |
| ·I 型PKS 基因 | 第20页 |
| ·II 型PKS 基因 | 第20-21页 |
| ·III 型PKS 基因 | 第21页 |
| ·聚酮类化合物的组合生物合成 | 第21-24页 |
| ·I 型PKS 的组合生物合成 | 第22页 |
| ·II 型PKS 的组合生物合成 | 第22-23页 |
| ·非核糖体多肽合成酶(NRPSs)的组合生物合成 | 第23-24页 |
| ·组合生物合成技术在聚酮类化合物合成中的应用 | 第24-26页 |
| ·将聚酮生物合成途径引入新的宿主 | 第24页 |
| ·提高聚酮化合物的产量 | 第24-25页 |
| ·合成新的抗生素 | 第25-26页 |
| ·组合生物合成在海洋放线菌中应用前景的展望 | 第26-29页 |
| ·放线菌遗传转化方法 | 第29-32页 |
| ·转化 | 第29-30页 |
| ·PEG-介导的质粒转化原生质体 | 第29-30页 |
| ·电穿孔 | 第30页 |
| ·接合转移 | 第30-31页 |
| ·转导 | 第31-32页 |
| ·本研究的意义及主要内容 | 第32-34页 |
| 第二章 PEG-介导原生质体转化及接合转移方法的建立 | 第34-67页 |
| 1 材料与方法 | 第34-48页 |
| ·材料 | 第34-38页 |
| ·菌种 | 第34-35页 |
| ·质粒 | 第35页 |
| ·培养基 | 第35-36页 |
| ·缓冲液 | 第36-37页 |
| ·Southern 杂交所用试剂 | 第37-38页 |
| ·方法 | 第38-48页 |
| ·四株海洋放线菌敏感性 | 第38-39页 |
| ·四株海洋放线菌对不同抗生素的敏感性 | 第38页 |
| ·敏感抗生素最佳作用浓度的筛选 | 第38-39页 |
| ·海洋放线菌固体培养时敏感抗生素最佳作用浓度的筛选 | 第39页 |
| ·PEG 介导原生质体的转化 | 第39-44页 |
| ·原生质体的制备 | 第39-40页 |
| ·菌丝体培养基 | 第40页 |
| ·P 缓冲液中蔗糖浓度对原生质体形成及再生的影响 | 第40页 |
| ·甘氨酸浓度对菌丝体生长、原生质体形成及再生的影响 | 第40页 |
| ·溶菌酶浓度对原生质体形成及再生的影响 | 第40页 |
| ·原生质体的再生 | 第40-41页 |
| ·放线菌质粒的转化 | 第41页 |
| ·放线菌质粒DNA 的提取 | 第41-42页 |
| ·大肠杆菌质粒的分离 | 第42页 |
| ·大肠杆菌Top10 感受态细胞的制备 | 第42-43页 |
| ·质粒DNA 的大肠杆菌转化 | 第43页 |
| ·限制性内切酶酶切反应 | 第43页 |
| ·从琼脂糖凝胶中分离纯化DNA | 第43-44页 |
| ·DNA 连接反应 | 第44页 |
| ·DNA 的保存 | 第44页 |
| ·大肠杆菌——海洋放线菌属间接合转移系统的建立 | 第44-47页 |
| ·海洋放线菌单孢子悬液的制备 | 第44页 |
| ·接合转移 | 第44-45页 |
| ·接合转化子的检测 | 第45页 |
| ·放线菌总基因组DNA 的提取 | 第45-46页 |
| ·Southern 杂交检测 | 第46-47页 |
| ·四株海洋放线菌菌株基因组上attB 位点的克隆以及多序列比对 | 第47-48页 |
| ·attB 位点的PCR 引物 | 第47页 |
| ·PCR 反应体系 | 第47-48页 |
| ·PCR 反应程序 | 第48页 |
| ·PCR 产物的T 载体克隆 | 第48页 |
| 2 结果与分析 | 第48-62页 |
| ·四株海洋放线菌敏感性 | 第48-49页 |
| ·海洋放线菌对不同抗生素的敏感性 | 第48-49页 |
| ·敏感抗生素最佳作用浓度的筛选 | 第49页 |
| ·PEG 介导原生质体转化条件的优化 | 第49-53页 |
| ·影响原生质体形成因素的探讨 | 第49-52页 |
| ·菌丝体的培养基筛选 | 第49-50页 |
| ·P 缓冲液中蔗糖浓度对原生质体形成及再生的影响 | 第50页 |
| ·甘氨酸浓度对菌丝体生长、原生质体形成及再生的影响 | 第50-51页 |
| ·溶菌酶浓度对原生质体形成及再生的影响 | 第51-52页 |
| ·原生质体再生条件的选择 | 第52-53页 |
| ·PEG 介导原生质体的遗传转化 | 第53页 |
| ·大肠杆菌——海洋放线菌接合转移 | 第53-58页 |
| ·接合转移条件的优化 | 第53-55页 |
| ·培养基的选择 | 第53页 |
| ·四株海洋放线菌孢子预萌发时间的摸索 | 第53-54页 |
| ·供体和受体比例的确定 | 第54-55页 |
| ·大肠杆菌与四株海洋放线菌菌株的属间接合转移 | 第55-57页 |
| ·穿梭质粒pPM801、pPM803 以及温敏型质粒pHZ132 向海洋放线菌的转移 | 第55页 |
| ·整合型质粒pIJ8600 向海洋放线菌的转移 | 第55-57页 |
| ·接合转化子的酶切验证 | 第57-58页 |
| ·菌株M048 整合质粒pIJ8600 后接合转化子的Southern 杂交检测 | 第58-59页 |
| ·四株海洋放线菌基因组上整合位点(attB)位点的克隆和比对 | 第59-62页 |
| ·四株海洋放线菌染色体上attB 位点的克隆 | 第59页 |
| ·四株海洋放线菌attB 序列的测序和比对 | 第59-62页 |
| 3 讨论 | 第62-65页 |
| 4 小结 | 第65-67页 |
| 第三章 四株海洋放线菌遗传转化体系的验证 | 第67-81页 |
| 1 材料与方法 | 第67-73页 |
| ·材料 | 第67-69页 |
| ·菌株 | 第67页 |
| ·质粒 | 第67页 |
| ·主要试剂 | 第67页 |
| ·常用缓冲液配制 | 第67-69页 |
| ·柱层析缓冲液 | 第67-68页 |
| ·SDS-PAGE 相关溶液 | 第68页 |
| ·免疫印迹(Western-blot)分析相关溶液 | 第68-69页 |
| ·重组别藻蓝蛋白抗氧化活性检测相关溶液 | 第69页 |
| ·方法 | 第69-73页 |
| ·质粒pAPIJ 的构建 | 第69页 |
| ·用接合转移法将质粒pAPIJ 转入四株海洋放线菌菌株中 | 第69-70页 |
| ·接合转化子的基因组提取、PCR 验证及基因组酶切Southern 杂交验证 | 第70-71页 |
| ·重组别藻蓝蛋白(rAPC)的表达 | 第71-72页 |
| ·蛋白粗提物的制备及SDS-PAGE 分析 | 第71页 |
| ·Western-blot 分析 | 第71-72页 |
| ·金属离子螯合亲和层析 | 第72-73页 |
| ·色谱行为 | 第72-73页 |
| ·柱料的再生 | 第73页 |
| ·纯化的rAPC 抗氧化活性分析 | 第73页 |
| 2 结果与分析 | 第73-78页 |
| ·质粒pAPIJ 的构建 | 第73-74页 |
| ·四株海洋放线菌转化株基因组的PCR 及Southern 杂交验证 | 第74-76页 |
| ·别藻蓝蛋白表达的SDS-PAGE 检测 | 第76页 |
| ·别藻蓝蛋白表达的Western blot 检测 | 第76-77页 |
| ·重组别藻蓝蛋白在菌株M097 中的纯化 | 第77-78页 |
| ·重组别藻蓝蛋白(rAPC)抗氧化活性检测 | 第78页 |
| 3 讨论 | 第78-79页 |
| 4 小结 | 第79-81页 |
| 第四章 三株海洋放线菌整合质粒pIJ8600 的生物活性检测 | 第81-100页 |
| 1 材料与方法 | 第81-86页 |
| ·材料 | 第81-82页 |
| ·菌种 | 第81页 |
| ·受试菌株 | 第81-82页 |
| ·培养基 | 第82页 |
| ·三株菌株的发酵培养基 | 第82页 |
| ·方法 | 第82-85页 |
| ·抑菌活性的检测 | 第82-83页 |
| ·菌株的发酵 | 第82-83页 |
| ·代谢产物的提取 | 第83页 |
| ·检测样品的制备 | 第83页 |
| ·受试菌株的培养 | 第83页 |
| ·生物活性检测 | 第83页 |
| ·薄层层析检测(TLC) | 第83-84页 |
| ·粗提物生物活性跟踪 | 第84页 |
| ·高相液相色谱-质谱(HPLC-MS)分析 | 第84页 |
| ·质粒pIJ8601(pIJ8600-tipA~-) 的构建 | 第84-85页 |
| ·用接合转移法将质粒pIJ8601 转入菌株M048 | 第85页 |
| ·M048/pIJ8601 转化株抑菌活性 | 第85页 |
| ·质粒pIJ8600 在菌株M048 染色体上拷贝数的验证 | 第85-86页 |
| ·随机引物法标记探针 | 第85页 |
| ·Southern 杂交 | 第85-86页 |
| ·M048/pIJ8600 转化株化合物的分离及结构解析 | 第86页 |
| 2 结果与分析 | 第86-97页 |
| ·抑菌活性筛选 | 第86-93页 |
| ·抑菌活性试验 | 第86-88页 |
| ·薄层层析(TLC)检测 | 第88-89页 |
| ·海洋放线菌菌株M048 转化质粒pIJ8601 后抑菌活性的变化 | 第89-90页 |
| ·活性示踪 | 第90-91页 |
| ·高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)结果 | 第91-93页 |
| ·质粒pIJ8600 在菌株M048 染色体上拷贝数 | 第93-94页 |
| ·海洋放线菌菌株M048 转化株次级代谢产物分离以及结构解析 | 第94-97页 |
| 3 讨论 | 第97-99页 |
| 4 小结 | 第99-100页 |
| 第五章 三株海洋放线菌PKS 基因功能的初步验证 | 第100-121页 |
| 1 材料与方法 | 第101-107页 |
| ·材料 | 第101页 |
| ·菌株 | 第101页 |
| ·质粒 | 第101页 |
| ·方法 | 第101-107页 |
| ·基因组步移 | 第101-103页 |
| ·主要试剂 | 第102页 |
| ·Universal GenomeWalker 工作原理 | 第102-103页 |
| ·三株海洋放线菌部分聚酮合酶(PKS)基因的克隆 | 第103-107页 |
| ·菌株M045 部分PKS 基因的克隆 | 第103-104页 |
| ·菌株M048 部分PKS 基因的克隆 | 第104-105页 |
| ·菌株M095 部分PKS 基因的克隆 | 第105-107页 |
| ·基因中断试验 | 第107页 |
| ·基因中断菌株的发酵和生物活性检测 | 第107页 |
| ·基因中断菌株发酵产物的高效液相色谱(HPLC)分析 | 第107页 |
| 2 结果与分析 | 第107-117页 |
| ·三株海洋放线菌菌株聚酮合成酶基因的克隆 | 第107-113页 |
| ·菌株M045 部分PKS 基因的克隆 | 第108-110页 |
| ·菌株M048 部分PKS 基因的克隆 | 第110-111页 |
| ·菌株M095 部分PKS 基因克隆 | 第111-113页 |
| ·接合转移以及活性菌株检测 | 第113-117页 |
| ·接合转移 | 第113页 |
| ·抑菌活性试验 | 第113-115页 |
| ·高效液相色谱分析基因中断转化株化合物的变化 | 第115-117页 |
| ·菌株M048 基因中断转化株的HPLC 检测 | 第115-116页 |
| ·菌株M095 基因中断转化株的HPLC 检测 | 第116-117页 |
| 3 讨论 | 第117-119页 |
| 4 小结 | 第119-121页 |
| 第六章 海洋放线菌菌株M045 基因组文库的构建 | 第121-131页 |
| 1 材料与方法 | 第121-125页 |
| ·材料 | 第121-122页 |
| ·菌株 | 第122页 |
| ·载体 | 第122页 |
| ·方法 | 第122-125页 |
| ·Fosmid 文库的构建 | 第122-124页 |
| ·Fosmid 文库插入片段大小的验证 | 第124页 |
| ·Fosmid 基因组文库的筛选 | 第124-125页 |
| 2 结果与分析 | 第125-129页 |
| ·菌株M045 基因组的提取及纯化 | 第125-126页 |
| ·随机打断M045 基因组 | 第126页 |
| ·脉冲场电泳 | 第126-127页 |
| ·补平的DNA 的回收 | 第127页 |
| ·插入片段大小的验证 | 第127-129页 |
| ·Fosmid 文库的筛选 | 第129页 |
| 3 讨论 | 第129-130页 |
| 4 小结 | 第130-131页 |
| 结论 | 第131-132页 |
| 参考文献 | 第132-149页 |
| 攻读博士期间发表文章 | 第149-150页 |
| 致谢 | 第150页 |
