| 前言 | 第1-21页 |
| 1 李坏死环斑病毒概述 | 第9-12页 |
| 1．1 李坏死环斑病毒的生物学 | 第9-10页 |
| 1．2 李坏死环斑病毒的分子结构 | 第10-11页 |
| 1．3 李坏死环斑病毒的检测方法 | 第11-12页 |
| 2 病原物的分子生物学检测技术进展 | 第12-20页 |
| 2．1 模板扩增的技术 | 第12页 |
| 2．1．1 PCR扩增技术 | 第12页 |
| 2．1．2 NASBA扩增技术 | 第12页 |
| 2．2 信号放大的技术 | 第12-13页 |
| 2．2．1 分支探针技术 | 第13页 |
| 2．2．2 肽核酸探针技术 | 第13页 |
| 2．3 模板扩增和信号放大相结合的技术 | 第13-14页 |
| 2．3．1 PCR-基因扫描检测PCR产物 | 第13页 |
| 2．3．2 PCR产物的安吉伦芯片检测 | 第13-14页 |
| 2．3．3 SYBRGREEN荧光检测技术 | 第14页 |
| 2．4 模板扩增和杂交及信号放大相结合的技术 | 第14-19页 |
| 2．4．1 PCR-ELISA技术 | 第14页 |
| 2．4．2 PCR-ELISA技术的种类 | 第14-16页 |
| 2．4．3 实时荧光PCR检测技术 | 第16-17页 |
| 2．4．4 实时荧光PCR技术的种类 | 第17-19页 |
| 2．5 生物芯片检测技术 | 第19-20页 |
| 3 本研究的目的和意义 | 第20-21页 |
| 材料和方法 | 第21-31页 |
| 1 试验材料 | 第21-22页 |
| 1．1 毒源 | 第21页 |
| 1．2 繁殖寄主 | 第21页 |
| 1．3 供试健康寄主 | 第21页 |
| 1．4 供试载体宿主菌株及载体 | 第21页 |
| 1．5 供试酶类及试剂盒 | 第21页 |
| 1．6 供试分子量标准 | 第21页 |
| 1．7 供试生化及分子生物学试剂 | 第21-22页 |
| 1．8 主要仪器 | 第22页 |
| 1．9 引物及探针 | 第22页 |
| 2 试验方法 | 第22-31页 |
| 2．1 毒原的接种 | 第22页 |
| 2．2 PNRSV和ToRSV的DAS-ELISA检测 | 第22页 |
| 2．3 核酸的提取 | 第22-23页 |
| 2．4 引物设计 | 第23-24页 |
| 2．5 RT-PCR反应 | 第24-25页 |
| 2．5．1 RNA反转DNA | 第24页 |
| 2．5．2 PCR扩增 | 第24页 |
| 2．5．3 PCR产物电泳 | 第24-25页 |
| 2．6 PCR产物的克隆 | 第25-27页 |
| 2．6．1 PCR产物的回收 | 第25页 |
| 2．6．2 PCR产物与载体的连接 | 第25页 |
| 2．6．3 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 | 第25页 |
| 2．6．4 克隆的筛选 | 第25-27页 |
| 2．7 诱捕PCR／RT-PCR-ELISA检测方法的建立 | 第27-28页 |
| 2．7．1 诱捕探针与杂交探针的设计 | 第27页 |
| 2．7．2 诱捕PCR管的制备 | 第27页 |
| 2．7．3 核酸的诱捕 | 第27页 |
| 2．7．4 PCR或RT-PCR | 第27-28页 |
| 2．7．5 液相产物电泳检测 | 第28页 |
| 2．7．6 固相产物的分子杂交和ELISA检测 | 第28页 |
| 2．8 实时荧光PCR和实时荧光RT-PCR检测方法的建立 | 第28-31页 |
| 2．8．1 样品的制备核酸的提取同前 | 第29页 |
| 2．8．2 荧光探针的设计 | 第29页 |
| 2．8．3 实时荧光PCR／RT-PCR检测 | 第29-30页 |
| 2．8．4 7700SDS软件的设置 | 第30页 |
| 2．8．5 数据分析和结果输出 | 第30-31页 |
| 结果与分析 | 第31-45页 |
| 1．1 接种后观察症状 | 第31页 |
| 1．2 PNRSV和ToRSV的DAS-ELISA检测 | 第31页 |
| 1．3 总RNA提取结果 | 第31-33页 |
| 1．3．1 RT-PCR扩增结果 | 第32-33页 |
| 1．4 PNRSV的RT-PCR产物的克隆和测序 | 第33-35页 |
| 1．4．1 重组质粒PCR和酶切鉴定 | 第33-34页 |
| 1．4．2 核酸序列测定和分析 | 第34-35页 |
| 1．5 诱捕参数的优化 | 第35-36页 |
| 1．5．1 诱捕的温度确定 | 第35页 |
| 1．5．2 诱捕时间的确定 | 第35-36页 |
| 1．6 确定不同引物比对ELISA检测的影响 | 第36页 |
| 1．7 探针杂交参数的优化 | 第36-38页 |
| 1．7．1 杂交温度的确定 | 第36-37页 |
| 1．7．2 杂交时间的确定 | 第37页 |
| 1．7．3 不同探针浓度的确定 | 第37-38页 |
| 1．8 诱捕PCR-ELISA的特异性 | 第38页 |
| 1．9 诱捕PCR的敏感性 | 第38-39页 |
| 1．10 对诱捕PCR管有效期试验 | 第39页 |
| 1．11 实时荧光PCR的条件的优化 | 第39-41页 |
| 1．11．1 优化引物浓度 | 第39-40页 |
| 1．11．2 探针浓度的优化 | 第40页 |
| 1．11．3 最佳Mg~（2+）离子浓度 | 第40-41页 |
| 1．11．4 最佳DNTP的浓度 | 第41页 |
| 1．13 实时荧光RT-PCR一步检测的特异性 | 第41-42页 |
| 1．14 灵敏度的确定 | 第42-43页 |
| 1．14．1 绝对灵敏度 | 第42-43页 |
| 1．14．2 相对灵敏灵 | 第43页 |
| 1．15 诱捕PCR-ELISA和实时荧光PCR检测梨火疫细菌 | 第43-45页 |
| 1．15．1 诱捕诱捕PCR-ELISA检测 | 第43-44页 |
| 1．15．2 实时荧光PCR检测 | 第44-45页 |
| 讨论 | 第45-50页 |
| 1．1 植物总RNA的提取 | 第45-46页 |
| 1．2 关于非特异性PCR扩增的问题 | 第46页 |
| 1．3 核酸的杂交 | 第46-47页 |
| 1．4 诱捕PCR-ELISA管的问题 | 第47页 |
| 1．5 实时荧光PCR的探针和退火温度 | 第47-48页 |
| 1．6 PCR检测污染的问题 | 第48-49页 |
| 1．7 几种检测方法在检验检疫中的应用 | 第49-50页 |
| 小结 | 第50-51页 |
| 参考文献 | 第51-59页 |
| 缩写词 | 第59-60页 |
| 致谢 | 第60-61页 |
| 个人简历 | 第61页 |
