| 摘要 | 第4-5页 |
| ABSTRACT | 第5页 |
| 1 前言 | 第8-17页 |
| 1.1 猪胃蛋白酶概述 | 第8-9页 |
| 1.1.1 猪胃蛋白酶应用价值 | 第8-9页 |
| 1.2 猪胃蛋白酶外源表达的研究现状 | 第9页 |
| 1.2.1 大肠杆菌表达体系生产猪胃蛋白酶 | 第9页 |
| 1.2.2 毕赤酵母表达体系生产猪胃蛋白酶 | 第9页 |
| 1.3 毕赤酵母表达系统 | 第9-10页 |
| 1.3.1 毕赤酵母表达系统优势 | 第9-10页 |
| 1.3.2 毕赤酵母表达系统特性 | 第10页 |
| 1.4 tRNA概述 | 第10-12页 |
| 1.4.1 tRNA | 第10-11页 |
| 1.4.2 tRNA丰度,密码子偏好性及其相互关系 | 第11页 |
| 1.4.3 稀有tRNA的添加与传统密码子优化之间的比较 | 第11-12页 |
| 1.5 tRNA丰度研究现状 | 第12-13页 |
| 1.5.1 原核表达系统中tRNA丰度研究现状 | 第12页 |
| 1.5.2 毕赤酵母tRNA丰度研究现状 | 第12-13页 |
| 1.6 毕赤酵母表达系统的改造------tRNA_(CCG)~(Pro)基因验证与共表达 | 第13-14页 |
| 1.7 立题背景与意义 | 第14-15页 |
| 1.8 主要研究内容 | 第15-16页 |
| 1.9 技术路线 | 第16-17页 |
| 2 材料与方法 | 第17-35页 |
| 2.1 实验材料 | 第17-22页 |
| 2.1.1 菌种与质粒 | 第17页 |
| 2.1.2 试剂 | 第17-19页 |
| 2.1.3 主要仪器和设备 | 第19-20页 |
| 2.1.4 主要培养基 | 第20-21页 |
| 2.1.5 主要试剂 | 第21-22页 |
| 2.2 实验方法 | 第22-35页 |
| 2.2.1 DNA分子操作方法 | 第22-25页 |
| 2.2.2 大肠杆菌DH5α(DE3)感受态的制备方法及其转化 | 第25-26页 |
| 2.2.3 毕赤酵母GS115感受态的制备方法及其转化 | 第26-27页 |
| 2.2.4 重组产胃蛋白酶毕赤酵母工程菌的构建 | 第27-28页 |
| 2.2.5 胃蛋白酶的酶活测定 | 第28-30页 |
| 2.2.6 重组毕赤酵母工程菌GS115-PGN的诱导表达 | 第30页 |
| 2.2.7 甲醇添加量不同对猪胃蛋白酶表达的影响 | 第30页 |
| 2.2.8 不同培养基对猪胃蛋白酶表达的影响 | 第30-31页 |
| 2.2.9 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第31页 |
| 2.2.10 发酵罐实验 | 第31-32页 |
| 2.2.11 毕赤酵母表达体系优化探索---改造毕赤酵母tRNA_(CCG)~(Pro)池 | 第32-34页 |
| 2.2.12 毕赤酵母tRNA基因共表达体系在不同培养基中的优势对比 | 第34-35页 |
| 3 结果与讨论 | 第35-51页 |
| 3.1 重组产猪胃蛋白酶毕赤酵母工程菌GS115-pPIC9K-PGN的构建 | 第35-37页 |
| 3.1.1 重组质粒pPIC9K-PGN的构建 | 第35-36页 |
| 3.1.2 AOX引物PCR检验 | 第36-37页 |
| 3.2 重组毕赤酵母工程菌产猪胃蛋白酶的发酵条件优化 | 第37-39页 |
| 3.2.1 确定最佳甲醇添加量 | 第37页 |
| 3.2.2 确定最适表达培养基 | 第37-39页 |
| 3.3 重组产猪胃蛋白酶毕赤酵母工程菌的诱导表达 | 第39-40页 |
| 3.3.1 产猪胃蛋白酶毕赤酵母工程菌表达水平 | 第39-40页 |
| 3.4 10L发酵罐高密度培养 | 第40-41页 |
| 3.5 毕赤酵母表达体系改造——tRNA基因共表达体系 | 第41-47页 |
| 3.5.1 表达载体的构建 | 第41-43页 |
| 3.5.2 重组毕赤酵母共表达体系菌株构建 | 第43页 |
| 3.5.3 重组毕赤酵母共表达体系菌株表达水平检测 | 第43-45页 |
| 3.5.4 tRNA_(CCG)~(Pro)基因的验证 | 第45-47页 |
| 3.6 tRNA基因共表达体系的验证 | 第47-49页 |
| 3.6.1 融合基因NFATc3T-GFP表达菌株的构建 | 第47-48页 |
| 3.6.2 NFATc3T-GFP融合蛋白表达水平检测 | 第48-49页 |
| 3.7 不同培养基中tRNA共表达的优势对比 | 第49-51页 |
| 4 结论 | 第51-53页 |
| 4.1 全文总结 | 第51页 |
| 4.2 论文的创新点 | 第51-52页 |
| 4.3 论文的不足之处 | 第52-53页 |
| 5 展望 | 第53-54页 |
| 6 参考文献 | 第54-60页 |
| 7 攻读硕士学位期间论文发表情况 | 第60-61页 |
| 8 致谢 | 第61-62页 |
