| 摘要 | 第5-7页 |
| ABSTRACT | 第7-9页 |
| 第一章 绪论 | 第15-28页 |
| 1.1 羰基还原酶 | 第15-18页 |
| 1.1.1 羰基还原酶的定义及分类 | 第15-17页 |
| 1.1.2 羰基还原酶催化不对称还原反应的机理 | 第17-18页 |
| 1.2 羰基还原酶催化手性醇不对称合成 | 第18-21页 |
| 1.2.1 手性醇 | 第18-19页 |
| 1.2.2 手性醇的不对称合成 | 第19-20页 |
| 1.2.3 羰基还原酶在催化手性合成中存在的问题 | 第20-21页 |
| 1.3 羰基还原酶的分子改造 | 第21-24页 |
| 1.3.1 定向进化 | 第21-22页 |
| 1.3.2 定点突变 | 第22-24页 |
| 1.4 羰基还原酶的辅酶再生策略 | 第24-26页 |
| 1.4.1 羰基还原酶的辅酶依赖性 | 第24页 |
| 1.4.2 羰基还原酶的辅酶再生 | 第24-26页 |
| 1.5 本研究的主要内容和意义 | 第26-28页 |
| 1.5.1 研究的主要内容 | 第26-27页 |
| 1.5.2 研究的主要意义 | 第27-28页 |
| 第二章 Acetobactersp.CCTCCM209061中反-Prelog羰基还原酶基因的克隆及高效表达 | 第28-50页 |
| 2.1 实验材料 | 第28-29页 |
| 2.1.1 菌株和质粒 | 第28-29页 |
| 2.1.2 培养基 | 第29页 |
| 2.1.3 试剂材料 | 第29页 |
| 2.2 实验设备 | 第29-30页 |
| 2.3 实验方法 | 第30-36页 |
| 2.3.1 目的基因获取的基本操作 | 第30-32页 |
| 2.3.2 重组表达载体的构建 | 第32-33页 |
| 2.3.3 重组菌的构建及鉴定 | 第33-34页 |
| 2.3.4 BL21(DE3)(pGEX-accr)内重组AcCR还原活性检测 | 第34-35页 |
| 2.3.5 不同培养条件对BL21(DE3)(pGEX-accr)催化活性的影响 | 第35-36页 |
| 2.3.6 BL21(DE3)(pGEX-accr)催化4’-氯苯乙酮不对称还原反应过程研究 | 第36页 |
| 2.4 结果与讨论 | 第36-48页 |
| 2.4.1 目的基因的获取 | 第36-37页 |
| 2.4.2 AcCR基因序列生物信息学分析 | 第37-39页 |
| 2.4.3 重组质粒的构建 | 第39-41页 |
| 2.4.4 重组BL21(DE3)(pGEX-accr)的诱导表达 | 第41页 |
| 2.4.5 培养条件对BL21(DE3)(pGEX-accr)细胞生长及重组AcCR还原活性的影响 | 第41-47页 |
| 2.4.6 BL21(DE3)(pGEX-accr)催化4’-氯苯乙酮不对称还原反应过程 | 第47-48页 |
| 2.5 本章小结 | 第48-50页 |
| 第三章 重组AcCR的酶学性质研究 | 第50-77页 |
| 3.1 实验材料 | 第50-51页 |
| 3.1.1 菌种和培养基 | 第50-51页 |
| 3.1.2 主要试剂 | 第51页 |
| 3.2 主要实验仪器 | 第51页 |
| 3.3 实验方法 | 第51-57页 |
| 3.3.1 重组羰基还原酶AcCR的分离纯化 | 第51-52页 |
| 3.3.2 重组羰基还原酶的蛋白浓度及酶活测定 | 第52-53页 |
| 3.3.3 重组羰基还原酶AcCR的最适反应温度及热稳定性研究 | 第53页 |
| 3.3.4 重组羰基还原酶AcCR的最适反应pH及pH稳定性研究 | 第53-54页 |
| 3.3.5 重组羰基还原酶AcCR的贮藏稳定性研究 | 第54页 |
| 3.3.6 金属离子和化学试剂对重组羰基还原酶AcCR催化活性的影响 | 第54页 |
| 3.3.7 重组羰基还原酶AcCR底物特异性研究 | 第54-55页 |
| 3.3.8 重组羰基还原酶AcCR的反应动力学研究 | 第55-57页 |
| 3.4 结果与讨论 | 第57-76页 |
| 3.4.1 重组羰基还原酶AcCR的分离纯化 | 第57-58页 |
| 3.4.2 重组羰基还原酶AcCR的辅酶依赖性 | 第58-59页 |
| 3.4.3 重组羰基还原酶AcCR的最适反应温度及热稳定性研究 | 第59-62页 |
| 3.4.4 重组羰基还原酶AcCR的最适反应pH及pH稳定性 | 第62-65页 |
| 3.4.5 重组羰基还原酶AcCR的贮藏稳定性 | 第65-66页 |
| 3.4.6 金属离子和化学试剂对重组羰基还原酶AcCR还原活性的影响 | 第66-68页 |
| 3.4.7 重组羰基还原酶AcCR的底物特异性研究 | 第68-72页 |
| 3.4.8 重组羰基还原酶AcCR的反应动力学研究 | 第72-76页 |
| 3.5 本章小结 | 第76-77页 |
| 第四章 羰基还原酶AcCR的分子改造 | 第77-105页 |
| 4.1 实验材料 | 第77-78页 |
| 4.1.1 菌种与质粒 | 第77-78页 |
| 4.1.2 主要试剂 | 第78页 |
| 4.2 主要实验仪器 | 第78页 |
| 4.3 实验方法 | 第78-81页 |
| 4.3.1 羰基还原酶AcCR三维结构建模 | 第78页 |
| 4.3.2 羰基还原酶AcCR突变热点预测 | 第78页 |
| 4.3.3 羰基还原酶AcCR与辅酶对接 | 第78页 |
| 4.3.4 羰基还原酶AcCR突变体获取 | 第78-80页 |
| 4.3.5 羰基还原酶AcCR突变体的分离纯化 | 第80页 |
| 4.3.6 羰基还原酶AcCR突变体的酶活测定 | 第80页 |
| 4.3.7 羰基还原酶AcCR与小分子底物对接 | 第80页 |
| 4.3.8 羰基还原酶AcCR突变体的酶学性质研究 | 第80-81页 |
| 4.3.9 羰基还原酶AcCR突变体的底物特异性 | 第81页 |
| 4.4 结果与讨论 | 第81-103页 |
| 4.4.1 羰基还原酶AcCR的同源建模结果分析 | 第81-83页 |
| 4.4.2 AcCR与辅酶对接结果 | 第83-84页 |
| 4.4.3 羰基还原酶AcCR突变体获取 | 第84-96页 |
| 4.4.4 羰基还原酶AcCR突变体的酶学性质研究 | 第96-100页 |
| 4.4.5 羰基还原酶AcCR突变体的动力学参数 | 第100-101页 |
| 4.4.6 羰基还原酶AcCR突变体的底物特异性 | 第101-103页 |
| 4.5 本章小结 | 第103-105页 |
| 第五章 AcCR突变体与GDH共表达体系的构建与应用 | 第105-133页 |
| 5.1 实验材料 | 第106页 |
| 5.1.1 菌株与质粒 | 第106页 |
| 5.1.2 主要化学试剂 | 第106页 |
| 5.1.3 培养基与培养条件 | 第106页 |
| 5.2 主要实验仪器 | 第106页 |
| 5.3 实验方法 | 第106-113页 |
| 5.3.1 葡萄糖脱氢酶基因(gdh)的获取 | 第106-107页 |
| 5.3.2 含GST标签的mut-accr的扩增 | 第107-108页 |
| 5.3.3 共表达质粒的构建 | 第108页 |
| 5.3.4 重组菌的诱导表达 | 第108页 |
| 5.3.5 酶活测定 | 第108-109页 |
| 5.3.6 不同重组BL21(DE3)细胞催化HAP不对称还原反应的研究 | 第109页 |
| 5.3.7 缓冲液pH对重组BL21(DE3)细胞催化HAP不对称还原反应的影响 | 第109-110页 |
| 5.3.8 反应温度对重组BL21(DE3)细胞催化HAP不对称还原反应的影响 | 第110页 |
| 5.3.9 底物浓度对重组BL21(DE3)细胞催化HAP不对称还原反应的影响 | 第110页 |
| 5.3.10 细胞浓度对重组BL21(DE3)细胞催化HAP不对称还原反应的影响 | 第110-111页 |
| 5.3.11 辅底物浓度对重组BL21(DE3)细胞催化HAP不对称还原反应的影响 | 第111页 |
| 5.3.12 外加产物对重组BL21(DE3)细胞催化HAP不对称还原反应的影响 | 第111页 |
| 5.3.13 双相体系中重组BL21(DE3)细胞催化HAP不对称还原反应研究 | 第111-113页 |
| 5.3.14 检测及分析方法 | 第113页 |
| 5.4 结果与讨论 | 第113-131页 |
| 5.4.1 目的基因的获得 | 第113-114页 |
| 5.4.2 重组质粒的构建 | 第114页 |
| 5.4.3 重组BL21(DE3)的诱导表达 | 第114-116页 |
| 5.4.4 辅酶供给对重组BL21(DE3)细胞催化HAP不对称还原反应的影响 | 第116-117页 |
| 5.4.5 缓冲液pH对重组BL21(DE3)细胞催化HAP不对称还原反应的影响 | 第117-119页 |
| 5.4.6 反应温度对重组BL21(DE3)细胞催化HAP不对称还原反应的影响 | 第119-120页 |
| 5.4.7 底物浓度对重组BL21(DE3)细胞催化HAP不对称还原反应的影响 | 第120-122页 |
| 5.4.8 细胞浓度对重组BL21(DE3)细胞催化HAP不对称还原反应的影响 | 第122-123页 |
| 5.4.9 葡萄糖用量对重组BL21(DE3)细胞催化HAP不对称还原反应的影响 | 第123-124页 |
| 5.4.10 外加产物对重组BL21(DE3)催化HAP不对称还原反应的影响 | 第124页 |
| 5.4.11 BL21(DE3)(pETDuet-gst-mut-accr-gdh)细胞催化HAP不对称还原反应的过程曲线 | 第124-125页 |
| 5.4.12 双相体系中重组BL21(DE3)细胞催化HAP不对称还原反应的研究 | 第125-131页 |
| 5.5 本章小结 | 第131-133页 |
| 结论与展望 | 第133-136页 |
| 参考文献 | 第136-150页 |
| 附录 | 第150-162页 |
| 附录1 基因序列 | 第150-152页 |
| 附录2 羰基化合物、手性醇及其衍生物的检测图谱 | 第152-162页 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 | 第162-164页 |
| 致谢 | 第164-166页 |
| 附件 | 第166页 |
