| 摘要 | 第3-4页 |
| Abstract | 第4页 |
| 第1章 前言 | 第7-14页 |
| 1.1 胆碱能神经元的研究 | 第7-10页 |
| 1.1.1 胆碱能神经元的功能 | 第7-8页 |
| 1.1.2 与胆碱能神经元相关的疾病 | 第8-10页 |
| 1.1.3 胆碱能神经元与睡眠相关方面 | 第10页 |
| 1.2 CRISPR/Cas9技术的研究 | 第10-12页 |
| 1.2.1 常用基因编辑技术 | 第10-11页 |
| 1.2.3 CRISPR/Cas9的相关应用 | 第11-12页 |
| 1.3 Cre/LoxP与内源性启动子模型的应用 | 第12-14页 |
| 第2章 实验材料 | 第14-21页 |
| 2.1 实验设备和试剂耗材 | 第14-16页 |
| 2.1.1 实验主要设备及器材 | 第14-15页 |
| 2.1.2 试剂耗材 | 第15-16页 |
| 2.2 抗体信息 | 第16-17页 |
| 2.3 引物信息 | 第17-18页 |
| 2.4 质粒信息 | 第18-20页 |
| 2.5 细胞来源 | 第20-21页 |
| 第3章 实验方法 | 第21-36页 |
| 3.1 ChAT基因序列信息获得 | 第21页 |
| 3.2 质粒构建 | 第21-26页 |
| 3.2.1 同源重组质粒的设计 | 第21-23页 |
| 3.2.2 同源重组质粒的构建 | 第23页 |
| 3.2.3 Cas9质粒的设计 | 第23-24页 |
| 3.2.4 Cas9引导序列的获得 | 第24-25页 |
| 3.2.5 Cas9质粒的构建 | 第25页 |
| 3.2.6 感受态转化 | 第25-26页 |
| 3.2.7 菌落鉴定 | 第26页 |
| 3.3 细胞准备 | 第26-30页 |
| 3.3.1 293ft细胞常规培养 | 第26-27页 |
| 3.3.2 H9-ESC细胞常规培养 | 第27-30页 |
| 3.4 T7酶切检验Cas9质粒的作用 | 第30-32页 |
| 3.4.1 293FT的转染 | 第30-31页 |
| 3.4.2 T7酶切实验 | 第31-32页 |
| 3.5 ChAT基因标记的细胞系的筛选 | 第32-34页 |
| 3.5.1 H9-ES细胞的电转 | 第32-33页 |
| 3.5.2 细胞系的药物筛选 | 第33页 |
| 3.5.3 细胞系的基因鉴定 | 第33-34页 |
| 3.6 ES细胞向胆碱能神经元的诱导分化 | 第34-35页 |
| 3.7 免疫荧光染色 | 第35-36页 |
| 第4章 结果与分析 | 第36-56页 |
| 4.1 同源重组与Cas9质粒的验证 | 第36-39页 |
| 4.1.1 同源重组质粒的获得 | 第36-38页 |
| 4.1.2 Cas9质粒的作用效果 | 第38-39页 |
| 4.2 H9-ESC细胞系免疫组化鉴定 | 第39-42页 |
| 4.3 ChAT基因标记的ES细胞系的鉴定结果 | 第42-48页 |
| 4.3.1 ChAT基因标记的ES细胞系的PCR鉴定 | 第42-44页 |
| 4.3.2 Ch AT 基因标记的 ES 细胞系的测序鉴定 | 第44-46页 |
| 4.3.3 ChAT基因标记的ES细胞系的免疫染色鉴定 | 第46-47页 |
| 4.3.4 ChAT基因标记的ES细胞系的荧光表达情况 | 第47-48页 |
| 4.4 ChAT基因标记的ES细胞系向胆碱能神经元的诱导分化 | 第48-56页 |
| 4.4.1 ChAT基因标记的ES向NSC分化 | 第48-50页 |
| 4.4.2 ChAT-zsGreen NSC细胞的荧光表达情况 | 第50-51页 |
| 4.4.3 NSC向胆碱能神经元分化 | 第51-56页 |
| 第5章 讨论 | 第56-58页 |
| 致谢 | 第58-59页 |
| 参考文献 | 第59-65页 |
