| 目录 | 第4-8页 |
| TABLE OF CONTENTS | 第8-12页 |
| 中文摘要 | 第12-16页 |
| ABSTRACT | 第16-21页 |
| 符号说明及縮写词 | 第22-26页 |
| 第一章 文献综述 | 第26-66页 |
| 1.1 粘细菌简介 | 第26-31页 |
| 1.1.1 粘细菌的分类地位及典型特征 | 第26-28页 |
| 1.1.2 粘细菌来源的次级代谢产物 | 第28-29页 |
| 1.1.3 纤维堆囊菌及其次级代谢产物 | 第29-31页 |
| 1.2 粘细菌来源的模块化PKS/NRPS化合物装配线特征 | 第31-51页 |
| 1.2.1 PKS/NRPS化合物生物合成概述 | 第31-32页 |
| 1.2.2 经典模块化PKS/NRPS装配线基本特征 | 第32-33页 |
| 1.2.3 粘细菌模块化PKS/NRPS新颖装配线特征 | 第33-50页 |
| 1.2.4 粘细菌来源的PKS/NRPS开发潜能 | 第50-51页 |
| 1.3 埃博霉素及其生物合成特征 | 第51-60页 |
| 1.3.1 埃博霉素基本特性 | 第51-53页 |
| 1.3.2 埃博霉素的基因簇特征及其生物合成途径 | 第53-54页 |
| 1.3.3 埃博霉素结构类似物及其特征 | 第54-60页 |
| 1.4 埃博霉素的异源表达研究进展概述 | 第60-64页 |
| 1.5 本论文开展思路及研究内容 | 第64-66页 |
| 第二章 埃博霉素基因簇上游非编码区的启动子定位及功能鉴定 | 第66-95页 |
| 2.1 实验材料 | 第67-71页 |
| 2.1.1 菌株及质粒 | 第67页 |
| 2.1.2 培养基 | 第67-68页 |
| 2.1.3 主要实验试剂 | 第68-70页 |
| 2.1.4 主要仪器及设备 | 第70-71页 |
| 2.1.5 软件工具及数据库 | 第71页 |
| 2.2 实验方法 | 第71-85页 |
| 2.2.1 纤维堆囊菌菌体培养及基因组提取 | 第71-72页 |
| 2.2.2 质粒载体及片段的酶切及连接、转化 | 第72-75页 |
| 2.2.2.1 质粒DNA的提取及酶切 | 第72-73页 |
| 2.2.2.2 酶切载体去磷酸化 | 第73页 |
| 2.2.2.3 片段的处理 | 第73-75页 |
| 2.2.3 片段的PCR扩增 | 第75-77页 |
| 2.2.3.1 引物设计及合成 | 第75-76页 |
| 2.2.3.2 PCR体系及程序 | 第76-77页 |
| 2.2.3.3 PCR片段的回收 | 第77页 |
| 2.2.4 启动子探针载体的构建 | 第77-78页 |
| 2.2.4.1 So0157-2来源的埃博霉素基因簇上游调控区片段的扩增及载体构建 | 第77-78页 |
| 2.2.4.2 其他菌株来源的埃博霉素基因簇上游调控区片段的扩增和载体构建 | 第78页 |
| 2.2.4.3 茎环结构的去除及质粒重组 | 第78页 |
| 2.2.4.4 质粒的转化、培养和测序验证 | 第78页 |
| 2.2.5 引物延伸分析实验 | 第78-81页 |
| 2.2.5.1 大肠杆菌RNA提取 | 第79-80页 |
| 2.2.5.2 反转录操作 | 第80-81页 |
| 2.2.5.3 cDNA纯化、荧光片段的CEQ分离检测与引物延伸结果的分析： | 第81页 |
| 2.2.6 氯霉素乙酰转移酶(CAT)表达水平检测 | 第81-85页 |
| 2.2.6.1 大肠杆菌生长曲线绘制 | 第82页 |
| 2.2.6.2 大肠杆菌转化子CAT活性测定 | 第82-85页 |
| 2.3 结果与分析 | 第85-92页 |
| 2.3.1 多菌株来源的埃博霉素基因簇调控区克隆、比对及启动子结构预测 | 第85-87页 |
| 2.3.2 不同菌株来源的埃博霉素基因簇启动子活性比较 | 第87-89页 |
| 2.3.2.1 大肠杆菌重组转化子生长曲线测定 | 第87-88页 |
| 2.3.2.2 重组转化子的CAT活性测定 | 第88-89页 |
| 2.2.3 So0157-2来源的埃博霉素基因簇启动子转录起始位点鉴定 | 第89-91页 |
| 2.2.4 So0157-2来源的启动子区片段续减分析 | 第91-92页 |
| 2.4 本章小结 | 第92-95页 |
| 第三章 ：埃博霉素基因簇内部启动子分析与验证 | 第95-103页 |
| 3.1 实验材料 | 第96页 |
| 3.1.1 菌株及质粒 | 第96页 |
| 3.1.2 培养基 | 第96页 |
| 3.1.3 主要实验试剂 | 第96页 |
| 3.1.4 主要仪器及设备 | 第96页 |
| 3.2 实验方法 | 第96-98页 |
| 3.2.1 纤维堆囊菌So0157-2菌体培养及基因组提取 | 第96页 |
| 3.2.2 质粒载体的酶切及连接、转化 | 第96页 |
| 3.2.3 启动子预测分析 | 第96-97页 |
| 3.2.4 启动子扩增的PCR反应体系及程序 | 第97-98页 |
| 3.2.5 埃博霉素基因簇内部启动子的克隆及载体构建 | 第98页 |
| 3.2.6 氯霉素乙酰转移酶(CAT)表达水平检测 | 第98页 |
| 3.3 结果与分析 | 第98-102页 |
| 3.3.1 埃博霉素基因簇内部启动子预测分析 | 第98-99页 |
| 3.3.2 埃博霉素基因簇内部启动子的克隆表达及活性检测 | 第99-102页 |
| 3.3.2.1 启动子片段的扩增及重组质粒构建 | 第99-100页 |
| 3.3.2.2 启动子的活性测定 | 第100-102页 |
| 3.4 本章小结 | 第102-103页 |
| 第四章 埃博霉素基因簇的拼接及异源表达 | 第103-154页 |
| 4.1 实验材料 | 第104-108页 |
| 4.1.1 菌株及质粒 | 第104-105页 |
| 4.1.2 培养基 | 第105页 |
| 4.1.3 主要实验试剂 | 第105-107页 |
| 4.1.4 主要仪器及设备 | 第107页 |
| 4.1.5 软件工具及数据库 | 第107-108页 |
| 4.2 实验方法 | 第108-131页 |
| 4.2.1 纤维堆囊菌基本操作 | 第108页 |
| 4.2.2 大肠杆菌中质粒载体的构建 | 第108-112页 |
| 4.2.2.1 质粒载体及片段的酶切、连接及转化 | 第108-112页 |
| 4.2.3 重组载体的构建 | 第112-122页 |
| 4.2.3.1 引物设计 | 第112-114页 |
| 4.2.3.2 PCR反应及片段的酶切回收纯化 | 第114页 |
| 4.2.3.3 载体构建流程 | 第114-122页 |
| 4.2.4 粘球菌的电转化及突变株的筛选、纯化 | 第122-127页 |
| 4.2.4.1 抗生素浓度测定 | 第122页 |
| 4.2.4.2 粘球菌生长曲线测定 | 第122页 |
| 4.2.4.3 粘球菌菌株的电转化 | 第122-123页 |
| 4.2.4.4 粘球菌重组突变株的筛选及纯化 | 第123页 |
| 4.2.4.5 粘球菌基因敲除突变株的筛选及纯化 | 第123-124页 |
| 4.2.4.6 粘球菌突变株的菌落PCR验证 | 第124-126页 |
| 4.2.4.7 突变株的保存 | 第126页 |
| 4.2.4.8 氯霉素乙酰转移酶(CAT)的活性测定 | 第126-127页 |
| 4.2.4.9 转座子随机插入位点的确证 | 第127页 |
| 4.2.5 埃博霉素产物的提取及检测 | 第127-129页 |
| 4.2.5.1 含有埃博霉素基因簇的粘球菌突变株的液体发酵 | 第127-128页 |
| 4.2.5.2 发酵树脂的处理 | 第128页 |
| 4.2.5.3 HPLC及HPLC-MS检测 | 第128-129页 |
| 4.2.6 转录组测序及分析 | 第129-131页 |
| 4.3 结果与分析 | 第131-151页 |
| 4.3.1 含有埃博霉素基因簇的文库质粒Cosmid10和Fosmid3B11的鉴定分析 | 第131-132页 |
| 4.3.2 粘球菌生长参数的测定 | 第132-134页 |
| 4.3.2.1 粘球菌生长曲线测定 | 第132-133页 |
| 4.3.2.2 粘球菌对抗生素耐受水平测定 | 第133-134页 |
| 4.3.3 埃博霉素基因簇启动子在粘球菌中的活性验证 | 第134-135页 |
| 4.3.4 埃博霉素基因簇在粘球菌DK1622内的拼接组装 | 第135-137页 |
| 4.3.5 埃博霉素基因簇在大肠杆菌内的拼接组装 | 第137-139页 |
| 4.3.6 埃博霉素基因簇整合至粘球菌基因组 | 第139-140页 |
| 4.3.7 突变株插入位点验证 | 第140-142页 |
| 4.3.8 埃博霉素异源表达和发酵检测 | 第142-144页 |
| 4.3.9 突变株的转录组测序分析 | 第144-151页 |
| 4.3.9.1 转录组数据量统计及整体质量评估 | 第144-145页 |
| 4.3.9.2 表达差异分析 | 第145-146页 |
| 4.3.9.3 差异基因GO注释 | 第146-149页 |
| 4.3.9.4 与埃博霉素表达相关的基因的预测 | 第149-151页 |
| 4.4 本章小结 | 第151-154页 |
| 第五章 埃博霉素基因簇在粘球菌中的修饰改造 | 第154-169页 |
| 5.1 实验材料 | 第155-157页 |
| 5.1.1 菌株及质粒 | 第155-156页 |
| 5.1.2 培养基 | 第156页 |
| 5.1.3 主要实验试剂 | 第156-157页 |
| 5.1.4 主要仪器及设备 | 第157页 |
| 5.1.5 软件工具及数据库 | 第157页 |
| 5.2 实验方法 | 第157-163页 |
| 5.2.1 质粒载体及片段的酶切、连接及转化 | 第157页 |
| 5.2.2 相关载体的构建 | 第157-162页 |
| 5.2.2.1 引物设计 | 第157-158页 |
| 5.2.2.2 PCR反应及片段的酶切回收纯化 | 第158-159页 |
| 5.2.2.3 敲除载体pBJ-ACdel和pBJ-FACdel的构建 | 第159-160页 |
| 5.2.2.4 核外表达质粒pZJY41-epoA和pZJY41-epoAP的构建 | 第160-161页 |
| 5.2.2.5 核外表达质粒pZJY41-epoD和pZJY41-epoE的构建 | 第161-162页 |
| 5.2.3 粘球菌的电转化及突变株的筛选、纯化 | 第162-163页 |
| 5.2.4 埃博霉素产物的提取及检测 | 第163页 |
| 5.3 结果与分析 | 第163-167页 |
| 5.3.1 埃博霉素异源表达菌株M.xanthus DZ2-9中抗性标记的敲除 | 第163-166页 |
| 5.3.2 过表达埃博霉素基因簇内的不同ORF对菌株发酵产量的影响 | 第166-167页 |
| 5.4 本章小结 | 第167-169页 |
| 总结与展望 | 第169-172页 |
| 附录 | 第172-181页 |
| 参考文献 | 第181-190页 |
| 致谢 | 第190-191页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 | 第191-192页 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 | 第192-193页 |
| 附件 | 第193-219页 |
