| 符号说明 | 第7-8页 |
| 摘要 | 第8-9页 |
| ABSTRACT | 第9-10页 |
| 第一部分 基因功能研究方法概述 | 第11-25页 |
| 1 基因功能研究概述 | 第11页 |
| 2 基因功能验证方法 | 第11-21页 |
| 2.1 基因功能获得的方法 | 第11-12页 |
| 2.1.1 基因过表达技术 | 第11-12页 |
| 2.1.2 基因敲入技术 | 第12页 |
| 2.2 基因功能失活的方法 | 第12-14页 |
| 2.2.1 反义技术 | 第12-13页 |
| 2.2.2 基因诱捕技术 | 第13-14页 |
| 2.2.3 人工染色体转导技术 | 第14页 |
| 2.2.4 基因敲除技术 | 第14页 |
| 2.3 新兴的基因定点修饰技术 | 第14-18页 |
| 2.3.1 锌指核酸酶技术 | 第15页 |
| 2.3.2 转录激活类效应因子核酸酶技术 | 第15-16页 |
| 2.3.3 CRISPR/Cas系统 | 第16-18页 |
| 2.4 三种基因定点修饰技术的比较 | 第18-21页 |
| 参考文献 | 第21-25页 |
| 第二部分 利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼Igalda等9个基因的突变体 | 第25-165页 |
| 第一章 前言 | 第25-37页 |
| 1 研究背景 | 第25-26页 |
| 2 基因介绍 | 第26-37页 |
| 2.1 ZKO1114基因 | 第26页 |
| 2.2 ZKO1130基因 | 第26-27页 |
| 2.3 ZKO1131基因 | 第27页 |
| 2.4 ZKO1133-ZKO1136基因 | 第27-35页 |
| 2.5 ZKO1137基因 | 第35-36页 |
| 2.6 ZKO1138基因 | 第36-37页 |
| 3 研究目的和意义 | 第37页 |
| 第二章 实验材料与方法 | 第37-159页 |
| 1 实验动物及饲养条件 | 第37-38页 |
| 2 实验方法 | 第38-50页 |
| 2.1 生物信息学方法 | 第38页 |
| 2.1.1 基因信息的获取 | 第38页 |
| 2.1.2 基因信息的预测、分析及软件使用 | 第38页 |
| 2.2 分子克隆及检测相关方法 | 第38-44页 |
| 2.2.1 斑马鱼尾鳍或胚胎基因组的提取 | 第38-39页 |
| 2.2.2 PCR扩增 | 第39-40页 |
| 2.2.3 DNA回收纯化 | 第40页 |
| 2.2.4 DNA连接 | 第40页 |
| 2.2.5 DNA转化 | 第40-41页 |
| 2.2.6 阳性克隆的筛选与鉴定 | 第41页 |
| 2.2.7 质粒提取 | 第41页 |
| 2.2.8 Cas9 mRNA和sgRNA体外转录 | 第41-42页 |
| 2.2.9 RNA纯化 | 第42-43页 |
| 2.2.10 斑马鱼组织总RNA提取 | 第43-44页 |
| 2.2.11 突变体筛选的检测方法 | 第44页 |
| 2.3 斑马鱼受精卵显微注射方法 | 第44-45页 |
| 2.3.1 注射针头的制备 | 第44-45页 |
| 2.3.2 注射平皿的制备 | 第45页 |
| 2.3.3 斑马鱼受精卵的准备 | 第45页 |
| 2.3.4 样品的混合与针头装液 | 第45页 |
| 2.4 CRISPR/Cas9技术操作及突变体筛选 | 第45-50页 |
| 2.4.1 基因靶位点的选择 | 第45-46页 |
| 2.4.2 基因靶位点特异性检测及脱靶位点筛查 | 第46-47页 |
| 2.4.3 基因(嵌套)引物的设计与特异性检测 | 第47-48页 |
| 2.4.4 制备sgRNA | 第48-49页 |
| 2.4.5 靶点有效性检测方法 | 第49页 |
| 2.4.6 F0代斑马鱼的制备与突变效率检测 | 第49页 |
| 2.4.7 F0代斑马鱼突变携带体的筛选 | 第49-50页 |
| 2.4.8 F1代斑马鱼杂合突变体的筛选 | 第50页 |
| 2.4.9 F2代斑马鱼纯合突变体的筛选 | 第50页 |
| 2.5 斑马鱼表型分析实验 | 第50页 |
| 3 实验结果与分析 | 第50-151页 |
| 3.1 斑马鱼基因组的获得 | 第50-51页 |
| 3.2 Cas9 mRNA的获得 | 第51-52页 |
| 3.3 ZKO1114基因突变体的构建 | 第52-62页 |
| 3.4 ZKO1130基因突变体的构建 | 第62-72页 |
| 3.5 ZKO1131基因突变体的构建 | 第72-85页 |
| 3.6 ZKO1133基因突变体的构建 | 第85-97页 |
| 3.7 ZKO1134和ZKO1135基因突变体的构建 | 第97-113页 |
| 3.8 ZKO1136基因突变体的构建 | 第113-126页 |
| 3.9 ZKO1137基因突变体的建立及表型的初步分析 | 第126-138页 |
| 3.9.1 ZKO1137基因突变体的构建 | 第126-137页 |
| 3.9.2 ZKO1137基因表型的初步分析 | 第137-138页 |
| 3.10 ZKO1138基因突变体的建立及表型的初步分析 | 第138-151页 |
| 3.10.1 ZKO1138基因突变体的构建 | 第138-150页 |
| 3.10.2 ZKO1138基因表型的初步分析 | 第150-151页 |
| 4 总结与讨论 | 第151-156页 |
| 4.1 总结 | 第151-152页 |
| 4.2 讨论 | 第152-156页 |
| 4.2.1 打靶效率 | 第153-154页 |
| 4.2.2 脱靶效应 | 第154-155页 |
| 4.2.3 靶向突变 | 第155页 |
| 4.2.4 异常突变 | 第155-156页 |
| 4.2.5 性别转换 | 第156页 |
| 5 展望 | 第156-159页 |
| 参考文献 | 第159-165页 |
| 附录 | 第165-169页 |
| 致谢 | 第169-170页 |
| 附件 | 第170页 |
