| 致谢 | 第4-6页 |
| 摘要 | 第6-8页 |
| ABSTRACT | 第8-9页 |
| 1 引言 | 第13-27页 |
| 1.1 蛋白质的动态结构和功能 | 第13-14页 |
| 1.2 蛋白质动态结构研究的波谱学方法 | 第14-23页 |
| 1.2.1 荧光共振能量转移 | 第15-19页 |
| 1.2.2 顺磁核磁共振 | 第19-23页 |
| 1.3 蛋白质动态结构研究中的荧光探针和顺磁探针 | 第23-27页 |
| 1.3.1 荧光探针 | 第23-25页 |
| 1.3.2 顺磁探针 | 第25-27页 |
| 2 基于split GFP的新型蛋白质荧光标记探针的开发 | 第27-57页 |
| 2.1 引言 | 第27-29页 |
| 2.2 材料和方法 | 第29-39页 |
| 2.2.1 使用的材料试剂和仪器 | 第29-34页 |
| 2.2.2 质粒的构建 | 第34-35页 |
| 2.2.3 蛋白质的表达与纯化 | 第35-36页 |
| 2.2.4 Ub/GFP10-11与GFP1-9的结合测定 | 第36-37页 |
| 2.2.5 调控split-FPs的颜色 | 第37页 |
| 2.2.6 split GFP标记细胞表面膜蛋白 | 第37-39页 |
| 2.2.7 内化的定性和定量 | 第39页 |
| 2.3 结果 | 第39-49页 |
| 2.3.1 GFP1-9的制备 | 第39-40页 |
| 2.3.2 GFP1-9与Ub/GFP10-11的结合及其光谱性质 | 第40-41页 |
| 2.3.3 GFP1-9与Ub/GFP10-11的结合强度和结合速率 | 第41-42页 |
| 2.3.4 GFP1-9与Ub/GFP10-11结合后的荧光寿命 | 第42-43页 |
| 2.3.5 Split FP用于细胞表面膜蛋白的标记 | 第43-45页 |
| 2.3.6 Split GFP的标记对目标蛋白功能的影响 | 第45-46页 |
| 2.3.7 运用split GFP的标记方法研究GPR17和CysLT_2R的内化 | 第46-49页 |
| 2.4 讨论 | 第49-55页 |
| 2.4.1 GFP1-9的制备策略 | 第49-51页 |
| 2.4.2 Split GFP标记与全长GFP融合标记比较 | 第51-52页 |
| 2.4.3 GFP1-9'帽子'与GFP1-10"帽子"比较 | 第52-53页 |
| 2.4.4 GFP1-9的标记速率 | 第53页 |
| 2.4.5 Split GFP荧光标记的颜色调控 | 第53-55页 |
| 2.4.6 split GFP标记方法的优势和劣势 | 第55页 |
| 2.5 结论 | 第55-57页 |
| 3 发展通过点击反应连接的刚性顺磁探针 | 第57-82页 |
| 3.1 引言 | 第57-59页 |
| 3.2 材料和方法 | 第59-64页 |
| 3.2.1 使用的材料试剂和仪器 | 第59-60页 |
| 3.2.2 蛋白质的表达与纯化 | 第60-62页 |
| 3.2.3 探针的合成 | 第62页 |
| 3.2.4 探针的连接反应 | 第62-63页 |
| 3.2.5 NMR实验 | 第63页 |
| 3.2.6 PCS数据分析和结构计算 | 第63-64页 |
| 3.3 结果 | 第64-74页 |
| 3.3.1 DTTA-C3-yne和DTTA-C4-yne的化学合成 | 第64-65页 |
| 3.3.2 探针的连接反应 | 第65-66页 |
| 3.3.3 DTTA-C3和DTTA-C4探针在Ub上的PCS | 第66-68页 |
| 3.3.4 DTTA-C3和DTTA-C4探针在EIIB上的PCS | 第68-69页 |
| 3.3.5 DTTA-C3和DTTA-C4探针的RDC效应 | 第69-70页 |
| 3.3.6 基于新探针PCS的复合体结构计算和优化 | 第70-74页 |
| 3.4 讨论 | 第74-81页 |
| 3.4.1 探针的连接条件 | 第74-75页 |
| 3.4.2 引入镧系金属离子的方法选择 | 第75-77页 |
| 3.4.3 DTTA-C3和DTTA-C4探针与现有的基于点击反应探针的比较 | 第77-80页 |
| 3.4.4 PCS作为结构约束的优势 | 第80-81页 |
| 3.5 结论 | 第81-82页 |
| 4 结合单分子荧光和顺磁核磁共振研究RSV衣壳蛋白的动态结构和功能 | 第82-104页 |
| 4.1 引言 | 第82-84页 |
| 4.2 材料和方法 | 第84-89页 |
| 4.2.1 使用的材料试剂和仪器 | 第84-85页 |
| 4.2.2 蛋白的表达和纯化 | 第85-86页 |
| 4.2.3 荧光探针的连接和smFRET数据采集和处理 | 第86-88页 |
| 4.2.4 顺磁探针的连接和NMR数据采集和处理 | 第88-89页 |
| 4.3 结果 | 第89-99页 |
| 4.3.1 Alex488,Cy5双标记荧光样品的制备 | 第89-90页 |
| 4.3.2 Confocal smFRET仪器校正 | 第90-93页 |
| 4.3.3 RSV CA smFRET实验的结果 | 第93-95页 |
| 4.3.4 通过PCS获取结构域间的距离约束 | 第95-99页 |
| 4.3.5 smFRET与NMR PCS实验约束的整合 | 第99页 |
| 4.4 讨论 | 第99-103页 |
| 4.4.0 RSV CA两个结构与在溶液中是相对独立运动的 | 第99-100页 |
| 4.4.1 smFRET的数据的拟合 | 第100-101页 |
| 4.4.2 荧光标记方式对smFRET结果的影响 | 第101-102页 |
| 4.4.3 RSV衣壳蛋白多态结构的生物学意义 | 第102-103页 |
| 4.5 结论 | 第103-104页 |
| 5 总结与展望 | 第104-107页 |
| 5.1 用于特异性标记细胞表面膜蛋白的荧光标记方法的开发和应用 | 第104页 |
| 5.2 用于蛋白质定点标记刚性顺磁探针的发展和应用 | 第104-105页 |
| 5.3 RSV衣壳蛋白动态结构的解析 | 第105页 |
| 5.4 展望 | 第105-107页 |
| 参考文献 | 第107-116页 |
| 附录A: DTTA-C3和DTTA-C4探针相关数据 | 第116-124页 |
| 附录B: ns级荧光寿命的测量方法 | 第124-128页 |
| 附录C: ms级荧光寿命的测量方法 | 第128-131页 |
| 附录D: 基于荧光强度滴定的平衡解离常数KD的测定 | 第131-133页 |
| 附录E: smFRET数据处理方法 | 第133-135页 |
| 附录F: 通过FRET原始数据挑Burst脚本 | 第135-140页 |
| 附录G: 使用matlab对smFRET数据进行高斯拟合脚本 | 第140-143页 |
| 作者简介及在学期间发表的学术论文与研究成果 | 第143-144页 |
