| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 引言 | 第13-14页 |
| 第1章 文献综述 | 第14-26页 |
| 1.1 木质纤维素生物质 | 第14-15页 |
| 1.1.1 木质纤维素生物质简介 | 第14页 |
| 1.1.2 木质纤维素的组成及其性质 | 第14-15页 |
| 1.2 纤维素酶 | 第15-17页 |
| 1.2.1 纤维素酶的简述 | 第15页 |
| 1.2.2 纤维素酶的组成 | 第15页 |
| 1.2.3 纤维素酶的作用机理 | 第15-16页 |
| 1.2.4 产纤维素酶的微生物 | 第16页 |
| 1.2.5 纤维素酶的应用 | 第16-17页 |
| 1.3 丝状真菌中纤维素酶的合成诱导调控及转录调控 | 第17-20页 |
| 1.3.0 碳源对丝状真菌纤维素酶的合成调控 | 第17页 |
| 1.3.1 转录调控因子 | 第17-18页 |
| 1.3.2 纤维素酶的诱导调控 | 第18页 |
| 1.3.3 糖转运蛋白 | 第18-19页 |
| 1.3.4 染色质调控及其他相关调控 | 第19-20页 |
| 1.4 丝状真菌的基因敲除技术 | 第20-23页 |
| 1.4.1 基因敲除技术的概述 | 第20页 |
| 1.4.2 基因敲除技术的分类 | 第20-22页 |
| 1.4.2.1 传统的基因敲除方法 | 第20-21页 |
| 1.4.2.2 新兴的基因敲除技术 | 第21-22页 |
| 1.4.3 丝状真菌基因敲除技术的存在问题及其研究现状 | 第22-23页 |
| 1.5 丝状真菌的基因改造手段 | 第23-24页 |
| 1.5.1 PEG/CaCl2原生质体转化 | 第23页 |
| 1.5.2 农杆菌介导的遗传转化 | 第23页 |
| 1.5.3 其他转化方法 | 第23-24页 |
| 1.6 课题研究依据 | 第24-26页 |
| 第2章 材料与方法 | 第26-32页 |
| 2.1 实验仪器 | 第26页 |
| 2.2 实验所用主要培养基 | 第26-27页 |
| 2.3 实验所用酶与分子试剂 | 第27页 |
| 2.4 实验所用菌株与质粒 | 第27页 |
| 2.5 主要实验试剂及溶液的配制 | 第27-29页 |
| 2.6 基础实验操作 | 第29-32页 |
| 2.6.1 大肠杆菌感受态的制备 | 第29-30页 |
| 2.6.2 葡萄糖和木糖标准曲线的制作 | 第30页 |
| 2.6.3 菌种储藏 | 第30-32页 |
| 第3章 碳阻遏因子creA基因敲除及对纤维素酶表达的影响 | 第32-60页 |
| 3.1 前言 | 第32页 |
| 3.2 实验材料 | 第32-34页 |
| 3.2.1 菌株与质粒 | 第32页 |
| 3.2.2 实验用酶和试剂 | 第32-33页 |
| 3.2.3 实验用溶液的配制 | 第33-34页 |
| 3.3 基因敲除原理 | 第34页 |
| 3.4 creA基因缺失菌株的构建 | 第34-44页 |
| 3.4.1 creA基因的扩增 | 第34-37页 |
| 3.4.2 creA同源臂creA1，creA2的扩增 | 第37-38页 |
| 3.4.3 同源臂(Sph1)creA1(Nco1)与marker质粒PGApyrF的连接 | 第38-39页 |
| 3.4.4 同源臂creA2与PGApyrF-creA1的连接 | 第39-40页 |
| 3.4.5 creA基因一次同源重组 | 第40-41页 |
| 3.4.6 中间转化子基因组提取和PCR的验证 | 第41页 |
| 3.4.7 柄蓝状菌creA缺失突变株的获取 | 第41-42页 |
| 3.4.8 creA缺失菌株的形态学分析 | 第42页 |
| 3.4.9 creA缺失菌株的纤维素酶和木糖酶的酶活测定 | 第42-43页 |
| 3.4.10 creA缺失菌株和EMM在筛选平板上的生长 | 第43-44页 |
| 3.5 实验结果 | 第44-57页 |
| 3.5.1 从柄蓝状菌EMM中获得creA基因 | 第44-47页 |
| 3.5.2 creA敲除基因盒PGcreA1-ApyrF-creA2的构建 | 第47-52页 |
| 3.5.3 一次同源重组转化子的获取 | 第52-53页 |
| 3.5.4 中间转化子的鉴定 | 第53页 |
| 3.5.5 标记基因循环（二次同源重组）转化子的获取 | 第53-54页 |
| 3.5.6 creA基因缺失菌株△creA的获取 | 第54页 |
| 3.5.7 △creA菌株的形态学分析 | 第54-55页 |
| 3.5.8 敲除creA基因对纤维素酶和木聚糖酶酶活的影响 | 第55-57页 |
| 3.5.9 creA缺失菌株和EMM在筛选平板上透明圈的生长情况 | 第57页 |
| 3.6 本章小结 | 第57-60页 |
| 第4章 柄蓝状菌Ku70缺失菌株的构建 | 第60-78页 |
| 4.1 前言 | 第60-61页 |
| 4.2 实验材料 | 第61-62页 |
| 4.2.1 菌株与质粒 | 第61页 |
| 4.2.2 实验用酶和生物试剂 | 第61页 |
| 4.2.3 实验所用溶液 | 第61-62页 |
| 4.3 基因敲除原理 | 第62页 |
| 4.4 Ku70基因敲除盒的构建 | 第62-65页 |
| 4.4.1 Ku70基因扩增 | 第62-63页 |
| 4.4.2 Ku70同源臂Ku70-1 和Ku70-2 的扩增 | 第63-64页 |
| 4.4.3 同源臂Ku70-1，Ku70-2 与循环标记质粒PGApyrF的连接 | 第64页 |
| 4.4.4 诱导Ku70第一次同源重组 | 第64页 |
| 4.4.5 中间转化子的验证 | 第64页 |
| 4.4.6 柄蓝状菌Ku70缺失菌株的获取 | 第64页 |
| 4.4.7 Ku70缺失菌株的特性研究 | 第64-65页 |
| 4.5 实验结果 | 第65-76页 |
| 4.5.1 从柄蓝状菌EMM中获取Ku70基因 | 第65-68页 |
| 4.5.2 同源臂Ku70-1、Ku70-2 的扩增 | 第68-70页 |
| 4.5.3 Ku70敲除基因盒PGApyrF-Ku70的构建 | 第70-73页 |
| 4.5.4 PEG/CaCl2原生质体转化 | 第73-74页 |
| 4.5.5 转化子的鉴定 | 第74-75页 |
| 4.5.6 循环标记基因 | 第75-76页 |
| 4.5.7 △ku70菌株的获取 | 第76页 |
| 4.6 本章小结 | 第76-78页 |
| 第5章 CRISPR/Cas9系统的初步探究 | 第78-88页 |
| 5.1 前言 | 第78页 |
| 5.2 CRISPR/Cas9系统实现多基因编辑原理 | 第78-80页 |
| 5.3 实验材料 | 第80-81页 |
| 5.3.1 菌株和质粒 | 第80页 |
| 5.3.2 分子试剂 | 第80-81页 |
| 5.3.3 实验溶液 | 第81页 |
| 5.4 实验方法 | 第81-83页 |
| 5.4.1 Cas9基因的获得 | 第81页 |
| 5.4.2 质粒PG-Cas9的构建 | 第81-82页 |
| 5.4.3 PCPtcbh2质粒的抽提 | 第82页 |
| 5.4.4 PCPtcbh2-Cas9重组载体的构建 | 第82-83页 |
| 5.4.5 原生质体转化 | 第83页 |
| 5.5 实验结果 | 第83-86页 |
| 5.5.1 质粒PG-Cas9质粒的构建 | 第83-84页 |
| 5.5.2 重组质粒PCP-Cas9(GFP)的构建 | 第84-85页 |
| 5.5.3 Cas9基因的表达 | 第85-86页 |
| 5.6 小结 | 第86-88页 |
| 第6章 总结与展望 | 第88-90页 |
| 6.1 总结 | 第88-89页 |
| 6.2 展望 | 第89-90页 |
| 参考文献 | 第90-98页 |
| 攻读硕士期间已发表的论文 | 第98-100页 |
| 致谢 | 第100页 |
