| 中英文缩略词 | 第8-11页 |
| 摘要 | 第11-13页 |
| ABSTRACT | 第13-15页 |
| 前言 | 第16-44页 |
| 1. 手足口病概述 | 第16-18页 |
| 1.1 HFMD在中国的流行病学 | 第16-17页 |
| 1.2 HFMD病因学和分子流行病学 | 第17-18页 |
| 1.3 HFMD的临床特征 | 第18页 |
| 2. EV71的流行病学 | 第18-23页 |
| 2.1 EV71临床流行病学 | 第18-20页 |
| 2.2 EV71在我国的流行 | 第20-21页 |
| 2.3 EV71的分子流行病学 | 第21-22页 |
| 2.4 EV71感染引起的疾病表现 | 第22-23页 |
| 2.5 EV71的实验室诊断 | 第23页 |
| 3. EV71的生命周期 | 第23-31页 |
| 3.1 EV71的基因组结构 | 第24页 |
| 3.2 EV71的衣壳 | 第24-25页 |
| 3.3 EV71的细胞受体 | 第25-27页 |
| 3.4 EV71的脱壳 | 第27-29页 |
| 3.5 EV71亚单位蛋白 | 第29-31页 |
| 4. EV71感染与宿主细胞反应 | 第31-34页 |
| 4.1 EV71病毒因子与细胞或组织嗜性 | 第31页 |
| 4.2 ITAFs与病毒翻译 | 第31-32页 |
| 4.3 EV71感染的转录组学分析 | 第32页 |
| 4.4 EV71感染的蛋白组学分析 | 第32-33页 |
| 4.5 EV71感染与miRNAs | 第33页 |
| 4.6 EV71感染与细胞自噬 | 第33-34页 |
| 4.7 EV71感染与细胞凋亡 | 第34页 |
| 5. EV71感染的致病机制 | 第34-36页 |
| 5.1 宿主免疫基因的多态性和EV71的易感性 | 第34-35页 |
| 5.2 EV71感染的神经致病机制 | 第35-36页 |
| 6. EV71研究的动物模型 | 第36-37页 |
| 7. 抗EV71感染的疫苗和药物研制 | 第37-41页 |
| 7.1 EV71疫苗 | 第38-39页 |
| 7.2 抗EV71感染的抗病毒药物 | 第39-41页 |
| 8. 本文关注的科学问题 | 第41-44页 |
| 第一部分 EV71感染人扁桃体上皮细胞和巨噬细胞的天然免疫应答反应 | 第44-96页 |
| 材料与方法 | 第44-71页 |
| 1. 实验材料 | 第44-50页 |
| 1.1 实验仪器 | 第44-45页 |
| 1.2 主要试剂 | 第45-46页 |
| 1.3 实验病毒株 | 第46页 |
| 1.4 实验细胞系 | 第46页 |
| 1.5 分子克隆菌种和限制性内切酶 | 第46-47页 |
| 1.6 主要抗体试剂 | 第47页 |
| 1.7 信号通路抑制剂 | 第47页 |
| 1.8 常用溶液配制方法 | 第47-49页 |
| 1.9 实验耗材 | 第49页 |
| 1.10 结果数据分析及相关软件 | 第49-50页 |
| 2. 实验方法 | 第50-71页 |
| 2.1 细胞复苏、传代培养和冻存 | 第50-51页 |
| 2.1.1 细胞培养基配制 | 第50页 |
| 2.1.2 细胞复苏 | 第50页 |
| 2.1.3 细胞传代培养 | 第50-51页 |
| 2.1.4 细胞冻存 | 第51页 |
| 2.2 EV71病毒培养和病毒滴度测定 | 第51-52页 |
| 2.2.1 EV71病毒培养 | 第51-52页 |
| 2.2.2 EV71病毒滴度测定 | 第52页 |
| 2.3 核酸提取 | 第52-53页 |
| 2.3.1 人和EV71总RNA提取 | 第52-53页 |
| 2.3.2 病毒核酸提取 | 第53页 |
| 2.4 RT-PCR和real-time PCR | 第53-57页 |
| 2.4.1 逆转录反应 | 第53-54页 |
| 2.4.2 PCR扩增引物 | 第54-55页 |
| 2.4.3 PCR扩增体系和扩增程序 | 第55-56页 |
| 2.4.4 PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳鉴定 | 第56页 |
| 2.4.5 PCR扩增产物回收 | 第56-57页 |
| 2.5 EV71绝对定量PCR标准品构建 | 第57-59页 |
| 2.5.1 EV71 P1片段的连接反应 | 第57页 |
| 2.5.2 EV71 P1片段的转化 | 第57-58页 |
| 2.5.3 EV71 P1克隆质粒的提取 | 第58-59页 |
| 2.5.4 EV71绝对定量PCR标准直线方程的建立 | 第59页 |
| 2.6 人白血病单核细胞U937诱导分化为巨噬细胞 | 第59页 |
| 2.7 人扁桃体上皮细胞的苏木精-伊红(HE)染色鉴定 | 第59-60页 |
| 2.8 人扁桃体上皮细胞的阿利新蓝-过碘酸雪夫氏(AB-PAS)染色鉴定 | 第60页 |
| 2.9 人扁桃体上皮细胞免疫细胞化学(ICC)鉴定 | 第60-61页 |
| 2.10 EV71感染细胞及细胞病变效应(CPE)观察 | 第61页 |
| 2.11 细胞免疫荧光 | 第61-62页 |
| 2.12 免疫印迹(Western Blotting)检测蛋白变化 | 第62-66页 |
| 2.12.1 蛋白样品制备 | 第62页 |
| 2.12.2 BCA法测定蛋白浓度 | 第62-63页 |
| 2.12.3 待测蛋白样品的SDS-PAGE | 第63-64页 |
| 2.12.4 待测蛋白样品的转膜 | 第64-65页 |
| 2.12.5 PVDF膜封闭 | 第65页 |
| 2.12.6 PVDF膜的一抗孵育 | 第65页 |
| 2.12.7 PVDF膜的二抗孵育 | 第65-66页 |
| 2.12.8 化学发光(ECL)检测目的蛋白 | 第66页 |
| 2.12.9 PVDF膜的重新利用 | 第66页 |
| 2.13 信号通路抑制剂处理人扁桃体上皮细胞和巨噬细胞 | 第66-68页 |
| 2.13.1 信号通路抑制剂配制 | 第66-68页 |
| 2.13.2 信号通路抑制剂有效浓度测定 | 第68页 |
| 2.13.3 信号通路抑制剂处理人扁桃体上皮细胞和巨噬细胞 | 第68页 |
| 2.14 酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞因子 | 第68-71页 |
| 实验结果 | 第71-93页 |
| 1. 人扁桃体上皮细胞的鉴定 | 第71-72页 |
| 2. 人单核细胞U937诱导分化为巨噬细胞 | 第72页 |
| 3. EV71绝对定量REAL-TIME PCR检测方法建立 | 第72-73页 |
| 4. 人扁桃体上皮细胞和巨噬细胞对EV71易感 | 第73-75页 |
| 5. SCARB2可能介导EV71感染人扁桃体上皮细胞和巨噬细胞 | 第75-77页 |
| 6. EV71感染人扁桃体上皮细胞和巨噬细胞能够激活正常的细胞因子反应 | 第77-82页 |
| 7. EV71感染人扁桃体上皮细胞和巨噬细胞早期活化PI3K/AKT和MAPKs途径 | 第82-84页 |
| 8. PI3K/AKT和MAPKs途径影响EV71病毒复制 | 第84-86页 |
| 9. PI3K/AKT和MAPKs途径与NF-κB途径之间存在交叉对话 | 第86-88页 |
| 10. PI3K/AKT和MAPKs途径影响促炎细胞因子和趋化因子的生成 | 第88-93页 |
| 讨论 | 第93-95页 |
| 小结 | 第95-96页 |
| 第二部分 TLR2异源二聚体识别EV71介导的抗病毒天然免疫应答研究 | 第96-126页 |
| 材料与方法 | 第96-100页 |
| 1. 实验材料 | 第96页 |
| 2. 实验方法 | 第96-100页 |
| 实验结果 | 第100-121页 |
| 1. EV71感染人巨噬细胞引起TLR2和TLR4转录水平上调 | 第100-102页 |
| 2. EV71感染人巨噬细胞早期上调TLR2转录水平 | 第102页 |
| 3. UV-EV71刺激人巨噬细胞能够上调TLR2转录 | 第102-103页 |
| 4. EV71 VLP刺激人巨噬细胞上调TLR2转录 | 第103-105页 |
| 5. EV71感染人扁桃体上皮细胞和巨噬细胞引起TLR2等PRRs表达 | 第105-107页 |
| 6. TLR2和TLR4与EV71的共定位及亚细胞定位 | 第107-109页 |
| 7. EV71感染人扁桃体上皮细胞和巨噬细胞活化的信号途径 | 第109-111页 |
| 8. EV71感染人扁桃体上皮细胞和巨噬细胞引起TLR2/TLR4异源二聚体形成 | 第111-113页 |
| 9. UV-EV71刺激人扁桃体上皮细胞和巨噬细胞引起TLR2/TLR4异源二聚体形成 | 第113-115页 |
| 10. TLR2异源二聚体能够抑制EV71的致细胞病变效应 | 第115-116页 |
| 11. 活化TLR2产生较强的促炎细胞因子和趋化因子反应 | 第116-117页 |
| 12. 小鼠巨噬细胞RAW264.7不支持EV71复制 | 第117-118页 |
| 13. EV71感染小鼠巨噬细胞引起促炎细胞因子和趋化因子反应 | 第118-119页 |
| 14. EV71感染小鼠巨噬细胞上调TLR2,TLR1,TLR6,RIG-1和MDA5转录 | 第119-121页 |
| 讨论 | 第121-123页 |
| 小结 | 第123-126页 |
| 全文结论 | 第126-128页 |
| 本文仍需要解决的科学问题 | 第128-130页 |
| 参考文献 | 第130-148页 |
| 文献综述 | 第148-160页 |
| 参考文献 | 第153-160页 |
| 个人简历 | 第160-162页 |
| 发表和投稿文章 | 第162-164页 |
| 致谢 | 第164-166页 |
| 附录 | 第166-170页 |
