| 摘要 | 第1-10页 |
| Abstract | 第10-13页 |
| 缩略词表(Abbreviation) | 第13-14页 |
| 第一章 文献综述 | 第14-24页 |
| 1 柑橘冻害现状分析 | 第14-15页 |
| 2 基因工程技术改善柑橘抗寒性 | 第15-21页 |
| ·冷驯化相关的细胞变化 | 第17-19页 |
| ·细胞膜结构的变化 | 第17页 |
| ·细胞抗氧化系统的变化 | 第17-18页 |
| ·钙信号系统的变化 | 第18-19页 |
| ·冷驯化过程中的分子水平变化 | 第19-20页 |
| ·柑橘遗传转化的研究 | 第20页 |
| ·报告基因的选择 | 第20-21页 |
| 3 本课题的提出和目的 | 第21-24页 |
| 第二章 融合载体的构建 | 第24-50页 |
| 1 材料与试剂 | 第24页 |
| 2 方法 | 第24-41页 |
| ·枳DNA的提取及检测 | 第24-25页 |
| ·CTAB大量法提取枳DNA | 第24-25页 |
| ·DNA质量检测与浓度测定 | 第25页 |
| ·PtCBF及其启动子克隆 | 第25-30页 |
| ·引物设计 | 第25页 |
| ·PCR扩增PtCBF及其启动子 | 第25-26页 |
| ·产物回收、克隆及测序 | 第26-30页 |
| ·目的片段回收 | 第26页 |
| ·目的片段与pMD18-T载体连接 | 第26-27页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞制备 | 第27-28页 |
| ·转化及蓝白斑筛选 | 第28页 |
| ·质粒提取(碱裂解法) | 第28-29页 |
| ·双酶切及PCR鉴定 | 第29-30页 |
| ·测序 | 第30页 |
| ·GFP的克隆 | 第30-34页 |
| ·引物设计 | 第30-31页 |
| ·模板PMV质粒的制备 | 第31页 |
| ·PCR扩增GFP序列 | 第31页 |
| ·产物回收、克隆及测序 | 第31-34页 |
| ·目的片段回收 | 第31页 |
| ·目的片段与pMD18-T载体连接 | 第31-32页 |
| ·连接载体转化大肠杆菌及蓝白斑筛选 | 第32页 |
| ·质粒提取 | 第32页 |
| ·双酶切及PCR鉴定质粒 | 第32-33页 |
| ·测序 | 第33-34页 |
| ·融合基因CG的构建 | 第34-38页 |
| ·酶切CBF | 第34页 |
| ·酶切GFP | 第34-35页 |
| ·构建融合基因CG | 第35-38页 |
| ·连接酶切片段 | 第35页 |
| ·连接片段纯化及转化T载体 | 第35-37页 |
| ·双酶切与PCR鉴定 | 第37-38页 |
| ·融合基因表达载体CG2301的构建 | 第38-41页 |
| ·酶切基础表达载体pcAMBIA2301 | 第38-39页 |
| ·酶切融合基因CG | 第39-40页 |
| ·纯化、连接酶切后的载体片段及融合基因片段 | 第40页 |
| ·连接载体转化大肠杆菌及蓝白斑筛选 | 第40页 |
| ·质粒提取 | 第40页 |
| ·双酶切及PCR鉴定 | 第40-41页 |
| ·测序 | 第41页 |
| 3 结果与分析 | 第41-48页 |
| ·PtCBF及其启动子的克隆 | 第41-44页 |
| ·枳基因组DNA的提取 | 第41-42页 |
| ·PtCBF及其启动子的扩增 | 第42-43页 |
| ·阳性克隆的鉴定 | 第43页 |
| ·枳CBF及其启动子序列的测序结果 | 第43-44页 |
| ·GFP的克隆 | 第44-45页 |
| ·质粒PMV的提取 | 第44页 |
| ·PCR扩增GFP序列 | 第44-45页 |
| ·阳性克隆的鉴定 | 第45页 |
| ·GFP序列的测序结果 | 第45页 |
| ·构建融合基因CG | 第45-47页 |
| ·PCR扩增CG | 第45-46页 |
| ·阳性克隆的鉴定 | 第46页 |
| ·CG序列的测序结果 | 第46-47页 |
| ·融合基因表达载体CG2301的构建 | 第47-48页 |
| ·基础载体pCAMBIA2301的提取 | 第47页 |
| ·酶切融合基因CG与基础表达载体pCAMBIA2301 | 第47-48页 |
| ·融合基因表达载体CG2301的构建及验证 | 第48页 |
| 4 讨论 | 第48-50页 |
| 第三章 枳CBF转化烟草 | 第50-59页 |
| 1 材料与试剂 | 第50-51页 |
| ·植物材料 | 第50页 |
| ·菌株与质粒 | 第50页 |
| ·主要试剂 | 第50页 |
| ·激素和抗生素贮存液的配制 | 第50页 |
| ·培养基 | 第50-51页 |
| 2 方法 | 第51-54页 |
| ·无菌苗的组织培养 | 第51页 |
| ·烟草的遗传转化 | 第51-53页 |
| ·农杆菌感受态细胞的制备 | 第51-52页 |
| ·融合基因表达载体CG2301转化农杆菌 | 第52页 |
| ·农杆菌的活化和制备 | 第52页 |
| ·烟草共培养 | 第52页 |
| ·选择分化培养 | 第52页 |
| ·选择生根培养 | 第52页 |
| ·烟草叶片总DNA的提取 | 第52-53页 |
| ·PCR检测转基因烟草 | 第53页 |
| ·低温处理转基因烟草及荧光检测 | 第53-54页 |
| 3 结果与分析 | 第54-57页 |
| ·转化材料的准备 | 第54页 |
| ·烟草叶盘法遗传转化 | 第54页 |
| ·转基因植株的鉴定 | 第54-56页 |
| ·转基因烟草植株基因组DNA的质量检测 | 第54-55页 |
| ·转基因烟草PCR鉴定 | 第55-56页 |
| ·低温处理转基因植株的荧光检测 | 第56-57页 |
| 3 讨论 | 第57-59页 |
| 第四章 枳CBF转化枳 | 第59-65页 |
| 1 材料与试剂 | 第59-60页 |
| ·植物材料 | 第59页 |
| ·菌株与质粒 | 第59页 |
| ·主要试剂 | 第59页 |
| ·培养基 | 第59-60页 |
| 2 方法 | 第60-62页 |
| ·转化材料的准备 | 第60页 |
| ·枳的遗传转化 | 第60-62页 |
| ·侵染菌液的制备 | 第60页 |
| ·枳上胚轴预培养 | 第60-61页 |
| ·侵染与共培养 | 第61页 |
| ·筛选培养、再生 | 第61页 |
| ·枳叶片总DNA的提取 | 第61页 |
| ·PCR检测转基因枳 | 第61-62页 |
| 3 结果与分析 | 第62-63页 |
| ·枳遗传转化 | 第62页 |
| ·转基因植株的鉴定 | 第62-63页 |
| ·转基因枳抗性芽DNA的质量检测 | 第62页 |
| ·转基因烟草PCR鉴定 | 第62-63页 |
| 4 讨论 | 第63-65页 |
| ·选择合适的外植体类型进行转化 | 第63页 |
| ·采用最佳的培养再生体系 | 第63-65页 |
| 参考文献 | 第65-71页 |
| 附录 | 第71-88页 |
| 附录一 序列测序结果 | 第72-75页 |
| 附录二 烟草的遗传转化 | 第75-76页 |
| 附录三 低温处理后转烟草中枳CBF的荧光表达 | 第76-85页 |
| 附录四 枳的遗传转化过程 | 第85-88页 |
| 致谢 | 第88页 |