| 中文摘要 | 第1-28页 |
| ABSTRACT | 第28-37页 |
| 符号说明 | 第37-39页 |
| 前言 | 第39-45页 |
| (一) HBV感染与肝细胞凋亡 | 第39页 |
| (二) HBV感染与TRAIL诱导的肝细胞凋亡 | 第39-42页 |
| (三) HBV关键性基因区段与TRAIL诱导的肝细胞凋亡 | 第42-45页 |
| 总体技术路线 | 第45-46页 |
| 第一部分 乙肝病毒核心抗原(HBc)对TRAIL诱导肝细胞凋亡的影响及机制探讨 | 第46-116页 |
| 第一章 含HBc基因片段真核表达载体的构建及表达 | 第46-65页 |
| 技术路线 | 第47页 |
| 材料与方法 | 第47-61页 |
| 1.材料 | 第47-51页 |
| ·质粒与菌株 | 第47-48页 |
| ·细胞和细胞培养 | 第48页 |
| ·生化试剂 | 第48页 |
| ·一般试剂 | 第48-50页 |
| ·主要实验仪器 | 第50-51页 |
| 2.方法 | 第51-61页 |
| ·HBc基因片段的PCR扩增、回收及纯化 | 第51-52页 |
| ·PCR扩增HBc基因片段 | 第51-52页 |
| ·HBc基因片段的大量扩增、回收与纯化 | 第52页 |
| ·目的基因与载体的连接和重组子的转化 | 第52-54页 |
| ·目的基因与载体的酶切、回收与纯化 | 第52-53页 |
| ·目的基因与载体的连接 | 第53-54页 |
| ·重组质粒的转化 | 第54页 |
| ·阳性重组子的筛选与鉴定 | 第54-56页 |
| ·碱变性法小量抽提质粒 | 第55页 |
| ·酶切筛选阳性重组子 | 第55-56页 |
| ·DNA自动测序与序列分析鉴定阳性重组子 | 第56页 |
| ·HBc重组质粒稳定转染肝癌细胞系的建立及其鉴定 | 第56-61页 |
| ·BEL7402、SMMC7721细胞的传代培养 | 第56页 |
| ·基因转染 | 第56-57页 |
| ·克隆筛选 | 第57页 |
| ·稳定筛选细胞的鉴定 | 第57-61页 |
| ·半定量RT-PCR检测HBc基因mRNA的表达 | 第57-58页 |
| ·Western blot检测HBc蛋白的表达: | 第58-61页 |
| 结果 | 第61-63页 |
| 1.HBc基因片段的PCR扩增、回收及纯化 | 第61页 |
| ·PCR扩增HBc基因片段 | 第61页 |
| ·回收、纯化PCR产物 | 第61页 |
| 2.pcDNA-HBc真核表达载体的构建及鉴定 | 第61-62页 |
| ·目的基因和载体的酶切回收 | 第61页 |
| ·目的基因与载体的连接、转化 | 第61页 |
| ·阳性重组子的筛选和鉴定 | 第61-62页 |
| 3.HBc基因稳定转染肝癌细胞系的建立及其鉴定 | 第62-63页 |
| ·试剂盒小量提取质粒 | 第62页 |
| ·阳性细胞克隆的筛选 | 第62页 |
| ·稳定筛选细胞的鉴定 | 第62-63页 |
| ·HBc mRNA表达的检测 | 第62-63页 |
| ·HBc蛋白表达的检测 | 第63页 |
| 讨论 | 第63-65页 |
| 第二章 HBc表达对TRAIL诱导肝细胞凋亡影响的体外研究 | 第65-73页 |
| 材料与方法 | 第65-69页 |
| 1.材料 | 第65-66页 |
| ·生物试剂 | 第65页 |
| ·试剂盒 | 第65页 |
| ·细胞和细胞培养 | 第65页 |
| ·化学试剂 | 第65-66页 |
| ·主要仪器设备及其它 | 第66页 |
| 2.方法 | 第66-69页 |
| ·CCK-8检测TRAIL对细胞生长的抑制效应 | 第66页 |
| ·TUNEL检测TRAIL诱导的凋亡效应 | 第66-67页 |
| ·Caspase3的活性检测分析TRAIL诱导的细胞凋亡 | 第67-68页 |
| ·反义封闭HBc的表达对TRAIL诱导凋亡的影响 | 第68-69页 |
| ·PS-asODNs/HBc的设计、合成和溶解 | 第68页 |
| ·PS-asODNs/HBc的反义封闭效率 | 第68-69页 |
| ·TUNEL检测反义封闭BEL7402-HBV1.1细胞中HBc的表达对TRAIL诱导凋亡的影响 | 第69页 |
| ·TUNEL检测BEL7402-HBx细胞中转染HBc对TRAIL诱导凋亡效应的影响 | 第69页 |
| 3.统计学处理 | 第69页 |
| 结果 | 第69-71页 |
| 1.HBc转染降低TRAIL对细胞的生长抑制效应 | 第69-70页 |
| 2.HBc转染抵抗TRAIL诱导的细胞凋亡 | 第70页 |
| ·TUNEL检测结果 | 第70页 |
| ·Caspase3活性检测的结果 | 第70页 |
| 3.反义封闭HBc的表达上调TRAIL诱导的凋亡 | 第70页 |
| 4.HBc转染逆转HBx对TRAIL诱导的凋亡效应 | 第70-71页 |
| 讨论 | 第71-73页 |
| 第三章 HBc表达对TRAIL诱导肝细胞凋亡影响的体内研究 | 第73-81页 |
| 材料与方法 | 第73-78页 |
| 1.材料 | 第73-74页 |
| ·动物和动物饲养 | 第73-74页 |
| ·质粒和菌种 | 第74页 |
| ·生化试剂和试剂盒 | 第74页 |
| ·主要仪器设备 | 第74页 |
| 2.方法 | 第74-78页 |
| ·试剂盒大量提取质粒pcDNA3、pcDNA-HBc、pcDNA-HBV1.1 | 第74-75页 |
| ·小鼠尾静脉高压注射法建立体内实验模型 | 第75-76页 |
| ·免疫组织化学方法检测HBc在肝组织中的表达 | 第76页 |
| ·HBc的表达对肝脏损伤的影响 | 第76-78页 |
| ·小鼠血清谷丙转氨酶水平的检测 | 第76-77页 |
| ·病理切片观察小鼠肝组织病理学改变 | 第77页 |
| ·TUNEL染色检测肝细胞凋亡率 | 第77-78页 |
| 3.统计学处理 | 第78页 |
| 结果 | 第78-79页 |
| 1.试剂盒大量提取质粒 | 第78页 |
| 2.HBc在小鼠肝组织内的表达 | 第78页 |
| 3.HBc的表达减轻乙肝病毒诱导的炎症反应和肝细胞凋亡 | 第78-79页 |
| ·小鼠血清谷丙转氨酶水平 | 第78-79页 |
| ·肝脏病理学改变 | 第79页 |
| ·TUNEL检测肝细胞凋亡 | 第79页 |
| 讨论 | 第79-81页 |
| 第四章 HBc表达抵抗TRAIL诱导凋亡的分子机制研究(体外) | 第81-95页 |
| 技术路线 | 第81页 |
| 材料与方法 | 第81-88页 |
| 1.材料 | 第81-83页 |
| ·细胞和细胞培养 | 第81-82页 |
| ·抗体 | 第82页 |
| ·引物 | 第82页 |
| ·生化试剂和试剂盒 | 第82-83页 |
| ·主要仪器设备 | 第83页 |
| 2.方法 | 第83-88页 |
| ·胞膜受体水平的检测 | 第83-85页 |
| ·半定量RT-PCR检测TRAIL受体的表达 | 第83页 |
| ·荧光定量RT-PCR检测DR5 mRNA水平的表达 | 第83-84页 |
| ·流式细胞术检测细胞表面TRAIL受体的表达 | 第84-85页 |
| ·Western blot检测DR5蛋白水平的表达 | 第85页 |
| ·胞浆凋亡通路水平的检测 | 第85-88页 |
| ·Western blot检测caspase3前体蛋白(procaspase 3)的表达 | 第85页 |
| ·线粒体非依赖途径的检测 | 第85-86页 |
| ·Western blot检测caspase 8前体蛋白(procaspase 8)的表达 | 第85-86页 |
| ·FLIP表达水平的检测 | 第86页 |
| ·线粒体依赖途径的检测 | 第86-88页 |
| ·Western blot检测caspase 9前体蛋白(procaspase 9)的表达 | 第86-87页 |
| ·Western blot检测Bid分子的活化 | 第87页 |
| ·Bax表达水平的检测 | 第87-88页 |
| 3.统计学处理 | 第88页 |
| 结果 | 第88-91页 |
| 1.HBc可降低DR5 mRNA和蛋白水平的表达 | 第88页 |
| ·半定量和荧光定量PCR检测TRAIL受体mRNA水平的表达 | 第88页 |
| ·流式细胞术检测TRAIL受体蛋白质水平的表达 | 第88页 |
| ·Western blot检测DR5蛋白水平的表达 | 第88页 |
| 2.HBc抑制TRAIL诱导的procaspases-3,8,9及Bid的降解 | 第88-91页 |
| ·Western blot检测Caspase 3活化水平 | 第88-89页 |
| ·线粒体非依赖途径 | 第89-90页 |
| ·Western blot检测Caspase 8活化水平 | 第89页 |
| ·FLIP表达水平检测 | 第89-90页 |
| ·线粒体依赖途径 | 第90-91页 |
| ·Western blot检测Caspase9活化水平 | 第90页 |
| ·Western blot检测Bid活化水平 | 第90页 |
| ·Bax表达水平检测 | 第90-91页 |
| 讨论 | 第91-95页 |
| 第五章 HBc表达抵抗TRAIL诱导凋亡的分子机制研究(体内) | 第95-100页 |
| 材料与方法 | 第95-97页 |
| 1.材料 | 第95页 |
| 2.方法 | 第95-97页 |
| ·试剂盒大量提取质粒pcDNA3、pcDNA-HBc、pcDNA-HBV1.1 | 第95页 |
| ·小鼠尾静脉高压注射法建立体内实验模型 | 第95页 |
| ·小鼠肝脏DR5表达水平检测 | 第95-96页 |
| ·Western blot检测小鼠肝细胞Procaspase3,8,9及其Bid的表达 | 第96-97页 |
| 3.统计学处理 | 第97页 |
| 结果 | 第97-98页 |
| 1.HBc下调肝细胞DR5的表达 | 第97-98页 |
| ·流式细胞术检测DR5蛋白质水平的表达 | 第97页 |
| ·Western blot检测DR5蛋白水平的表达 | 第97页 |
| ·免疫组织化学检测小鼠肝组织DR5表达 | 第97-98页 |
| 2.HBc下调小鼠肝细胞Procaspase3,8,9及其Bid的活化水平 | 第98页 |
| 讨论 | 第98-100页 |
| 第六章 HBc对DR5启动子活性的调控作用 | 第100-106页 |
| 材料与方法 | 第100-103页 |
| 1.材料 | 第100-102页 |
| 2.方法 | 第102-103页 |
| ·试剂盒大量提取质粒pcDNA3-HBc、pGL3-basic、pDR5PF | 第102页 |
| ·双荧光素酶报告基因系统检测HBc对DR5启动子活性的影响 | 第102-103页 |
| 3.统计学处理 | 第103页 |
| 结果 | 第103页 |
| HBc抑制DR5启动子活性 | 第103页 |
| 讨论 | 第103-106页 |
| 第七章 临床标本检测HBc与DR5表达的相关性研究 | 第106-111页 |
| 材料与方法 | 第106-108页 |
| 1.材料 | 第106页 |
| ·生物试剂 | 第106页 |
| ·抗体 | 第106页 |
| ·血清标本 | 第106页 |
| ·肝切片标本 | 第106页 |
| 2.方法 | 第106-108页 |
| ·ELISA检测慢性乙肝患者血清中HBc表达 | 第106-107页 |
| ·ELISA检测慢性乙肝患者和正常对照者血清中sDR5表达 | 第107页 |
| ·免疫组织化学方法检测慢性乙肝患者和正常对照者肝细胞DR4、DR5的表达 | 第107-108页 |
| 3.统计学处理 | 第108页 |
| 结果 | 第108-109页 |
| 1.慢性乙肝患者血清中HBc表达 | 第108页 |
| 2.慢性乙肝患者血清中sDR5表达水平降低 | 第108页 |
| 3.慢性乙肝患者肝细胞DR5表达水平降低 | 第108-109页 |
| 讨论 | 第109-111页 |
| 第八章 利用基因芯片分析HBc转染前后基因表达谱的变化 | 第111-116页 |
| 材料和方法 | 第111-113页 |
| 1.材料 | 第111-112页 |
| ·细胞培养 | 第111页 |
| ·引物 | 第111页 |
| ·生化试剂和试剂盒 | 第111-112页 |
| ·主要的仪器设备及其它 | 第112页 |
| 2.方法 | 第112-113页 |
| ·组织RNA的提取 | 第112页 |
| ·RNA纯化与质检 | 第112-113页 |
| ·质检合格RNA送检 | 第113页 |
| ·生物信息学分析 | 第113页 |
| ·差异表达基因的Real-time PCR验证 | 第113页 |
| 3.统计学处理 | 第113页 |
| 结果 | 第113-114页 |
| 1.RNA定量与质控 | 第113页 |
| 2.基因芯片差异表达结果分析 | 第113-114页 |
| 3.Real-time PCR验证差异表达的基因 | 第114页 |
| 讨论 | 第114-115页 |
| 小结 | 第115-116页 |
| 第二部分 乙肝病毒截短型中蛋白【MHBS(t)】影响TRAIL诱导肝细胞凋亡的机制探讨 | 第116-121页 |
| 材料与方法 | 第116-118页 |
| 1.材料 | 第116-117页 |
| ·细胞和细胞培养 | 第116页 |
| ·抗体 | 第116页 |
| ·生化试剂和试剂盒 | 第116-117页 |
| 2.方法 | 第117-118页 |
| ·Western blot检测细胞外调控蛋白激酶2(ERK2)的活化 | 第117页 |
| ·TUNEL流式细胞术检测PD98059抑制ERK2活化对MHBs(t)上调TRAIL诱导凋亡的影响 | 第117页 |
| ·Western blot检测PD98059封闭ERK2对凋亡通路分子的影响 | 第117-118页 |
| 结果 | 第118-119页 |
| 1.MHBs(t)增强ERK2的活化 | 第118页 |
| 2.抑制ERK2活化可逆转MHBs(t)对TRAIL诱导凋亡的影响 | 第118页 |
| 3.抑制ERK2活化可逆转MHBs(t)对凋亡通路分子的影响 | 第118-119页 |
| 讨论 | 第119-120页 |
| 小结 | 第120-121页 |
| 附图(FIGURES) | 第121-137页 |
| 参考文献 | 第137-148页 |
| 致谢 | 第148-149页 |
| 博士在读期间发表论文、论著目录及所获荣誉 | 第149-202页 |
| 一、主要发表及已录用论文 | 第149页 |
| 二、会议交流论文 | 第149-150页 |
| 三、参编论著 | 第150页 |
| 四、获得荣誉 | 第150页 |
| 五、成果鉴定及报奖 | 第150-151页 |
| 六、已发表及待发表英文论文全文 | 第151-202页 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 | 第202页 |
