| 摘要 | 第1-5页 |
| 英文摘要 | 第5-9页 |
| 1 引言 | 第9-20页 |
| ·植酸 | 第9-10页 |
| ·植酸的结构及理化性质 | 第9页 |
| ·植酸的抗营养作用 | 第9-10页 |
| ·植酸酶 | 第10-12页 |
| ·植酸酶的来源及分类 | 第10-11页 |
| ·植酸酶的作用 | 第11-12页 |
| ·植酸酶基因及基因工程研究进展 | 第12-14页 |
| ·植酸酶基因 | 第12-13页 |
| ·植酸酶的基因工程进展 | 第13-14页 |
| ·毕赤酵母外源基因表达系统简介 | 第14-19页 |
| ·毕赤酵母外源基因表达系统的优点 | 第14-15页 |
| ·表达载体 | 第15-17页 |
| ·整合方式 | 第17-18页 |
| ·转化方法 | 第18页 |
| ·影响外源基因在毕赤酵母表达的因素 | 第18-19页 |
| ·本研究的目的意义 | 第19-20页 |
| 2 材料和方法 | 第20-31页 |
| ·试验材料 | 第20-23页 |
| ·试验菌株、质粒 | 第20页 |
| ·主要仪器和设备 | 第20页 |
| ·酶及生化试剂 | 第20页 |
| ·培养基 | 第20-21页 |
| ·试剂与缓冲液 | 第21-22页 |
| ·贮备液 | 第22-23页 |
| ·方法 | 第23-31页 |
| ·黑曲霉基因组DNA提取 | 第23页 |
| ·PCR引物的设计 | 第23页 |
| ·植酸酶基因的PCR扩增 | 第23页 |
| ·植酸酶基因PCR产物的克隆 | 第23-24页 |
| ·阳性质粒的提取及酶切鉴定 | 第24页 |
| ·克隆片段的DNA序列测定 | 第24页 |
| ·植酸酶phyA_1基因表达载体的构建 | 第24-25页 |
| ·pPIC9K/phyA_1阳性克隆的筛选和鉴定 | 第25页 |
| ·毕赤酵母细胞的转化 | 第25-26页 |
| ·重组转化子甲醇利用型的平板筛选 | 第26页 |
| ·外源基因多拷贝整合转化子筛选 | 第26页 |
| ·重组转化子植酸酶酶活性的平板检测 | 第26-27页 |
| ·重组子的PCR鉴定 | 第27页 |
| ·植酸酶基因在毕赤酵母GS115中的诱导表达 | 第27页 |
| ·表达产物-植酸酶PHYA_1的酶活力测定 | 第27-28页 |
| ·重组植酸酶PHYA_1的蛋白含量测定 | 第28-29页 |
| ·SDS-PAGE凝胶的制备及发酵上清液的蛋白质电泳 | 第29页 |
| ·重组植酸酶PHYA_1的酶学性质研究 | 第29-30页 |
| ·植酸酶基因工程菌遗传稳定性检测 | 第30-31页 |
| 3 结果与分析 | 第31-45页 |
| ·植酸酶基因PHYA_1、PHYB_1的扩增、产物克隆及序列测定 | 第31-35页 |
| ·植酸酶基因phyA_1、phyB_1的PCR分离 | 第31-32页 |
| ·植酸酶phyA_1基因序列测定与分析 | 第32-33页 |
| ·植酸酶phyB_1基因序列测定与分析 | 第33-34页 |
| ·黑曲霉植酸酶结构预测 | 第34-35页 |
| ·植酸酶PHYA_1基因分泌型重组酵母表达载体的构建和鉴定 | 第35-37页 |
| ·PPIC9K/PHYA_1电击转化毕赤酵母及酵母转化子的筛选 | 第37-39页 |
| ·重组酵母表达质粒pPIC9K/phyA_1电击转化 | 第37页 |
| ·酵母转化子的甲醇利用表型筛选 | 第37-38页 |
| ·phyA_1基因多拷贝整合子筛选 | 第38页 |
| ·酵母转化子的植酸钙平板筛选 | 第38页 |
| ·酵母转化子的PCR鉴定 | 第38-39页 |
| ·酵母转化子的高效诱导表达 | 第39页 |
| ·植酸酶PHYA_1基因在毕赤酵母中的高效表达与表达产物的检测 | 第39-40页 |
| ·植酸酶酵母工程菌产酶曲线的测定 | 第39页 |
| ·phyA_1基因表达产物的SDS-PAGE检测 | 第39-40页 |
| ·植酸酶酵母工程菌的遗传稳定性分析 | 第40页 |
| ·重组植酸酶PHYA1的酶学性质研究 | 第40-45页 |
| ·重组植酸酶PHYA1的最适反应pH值测定 | 第40-41页 |
| ·重组植酸酶PHYA1的pH稳定性测定 | 第41页 |
| ·重组植酸酶PHYA1的最适反应温度测定 | 第41-42页 |
| ·重组植酸酶PHYA1的热稳定性测定 | 第42页 |
| ·金属离子对重组植酸酶PHYA_1活性的影响测定 | 第42-43页 |
| ·底物浓度对重组植酸酶活力的影响 | 第43-44页 |
| ·重组植酸酶米氏常数(Km)的测定 | 第44-45页 |
| 4 讨论 | 第45-48页 |
| ·植酸酶基因PHYA_1、PHYB_1的分离 | 第45页 |
| ·植酸酶PHYA_1的分泌表达 | 第45-46页 |
| ·重组植酸酶的酶学性质 | 第46-47页 |
| ·下一步工作设想 | 第47-48页 |
| 5 结论 | 第48-49页 |
| 6 参考文献 | 第49-54页 |
| 7 在读期间发表的学术论文 | 第54-55页 |
| 8 作者简历 | 第55-56页 |
| 9 致谢 | 第56-57页 |
| 附录 | 第57-62页 |
