| 摘要 | 第1-9页 |
| ABSTRACT | 第9-10页 |
| 第一章 绪论 | 第10-27页 |
| ·纤维素酶的性质、分子结构分析、功能及应用 | 第11-20页 |
| ·纤维素及纤维素酶 | 第11-12页 |
| ·纤维素酶的研究历程 | 第12-13页 |
| ·纤维素酶的性质及纤维素酶的降解机制 | 第13-14页 |
| ·纤维素酶的分子结构与功能 | 第14-18页 |
| ·CBD结构以及结构功能预测 | 第15-17页 |
| ·催化区的结构特征与功能 | 第17-18页 |
| ·纤维素酶的合成调控 | 第18-19页 |
| ·纤维素酶的应用 | 第19-20页 |
| ·农杆菌介导转化系统 | 第20-26页 |
| ·农杆菌 | 第20-21页 |
| ·根癌农杆菌分子生物学特征 | 第21-22页 |
| ·Ti质粒的结构与功能 | 第21页 |
| ·Ti质粒的转化机理 | 第21-22页 |
| ·农杆菌转化法 | 第22-24页 |
| ·农杆菌转化法 | 第22页 |
| ·影响农杆菌转化的因素 | 第22-24页 |
| ·根瘤农杆菌介导转化真菌体系 | 第24-26页 |
| ·真菌转化中的技术优势 | 第24页 |
| ·遗传转化筛选标记 | 第24-26页 |
| ·本研究的目的和意义 | 第26-27页 |
| 第二章 丝状真菌纤维素酶农杆菌转化系统的构建 | 第27-45页 |
| ·实验材料 | 第28-29页 |
| ·菌种和质粒 | 第28页 |
| ·分子克隆用酶和试剂 | 第28-29页 |
| ·培养基和溶液 | 第29页 |
| ·实验方法 | 第29-32页 |
| ·瑞氏木霉/粗糙脉孢菌孢子培养及处理 | 第29页 |
| ·根癌农杆菌感受态细胞的制备和转化 | 第29-30页 |
| ·根癌农杆菌中质粒的提取 | 第30-31页 |
| ·根瘤农杆菌的培养及处理 | 第31页 |
| ·根瘤农杆菌介导瑞氏木霉/粗糙脉孢菌转化 | 第31页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第31-32页 |
| ·引物设计 | 第32页 |
| ·cbh1真核表达元件构建引物定义为:P_1/P_2 | 第32页 |
| ·cbh1真核表达元件扩增引物定义为P_3/P_4 | 第32页 |
| ·结果与讨论 | 第32-45页 |
| ·粗糙脉孢菌ppt抗性实验,确定抗生素浓度 | 第32-33页 |
| ·根瘤农杆菌转化粗糙脉孢菌实验 | 第33-34页 |
| ·乙酰丁香酮浓度以及孢子浓度对根瘤农杆菌转化的影响 | 第33-34页 |
| ·农杆菌介导转化转化 | 第34页 |
| ·野生型纤维素外切酶农杆菌介导转化质粒构建 | 第34-38页 |
| ·丝状真菌组成型表达元件构建 | 第35页 |
| ·cbh1基因获得 | 第35-36页 |
| ·pBPT19一cbh1构建 | 第36-38页 |
| ·构建农杆菌转化质粒pB01-cbh1-bar质粒 | 第38-41页 |
| ·质粒转化根瘤农杆菌 | 第41-42页 |
| ·农杆菌介导将CBHⅠ基因转化到粗糙脉孢菌 | 第42-45页 |
| ·CBHⅠ基因组成型表达元件转化粗糙脉孢菌 | 第42-45页 |
| 第三章 纤维素酶的组成型表达 | 第45-54页 |
| ·实验材料 | 第45-46页 |
| ·菌种和溶液 | 第45-46页 |
| ·实验方法 | 第46-50页 |
| ·发酵方法及生长曲线测定 | 第46-47页 |
| ·SDS凝胶电泳 | 第47页 |
| ·pNP法酶活测定 | 第47-49页 |
| ·pNP标准曲线的绘制 | 第47-48页 |
| ·pNPC测定外切酶CBHⅠ活性 | 第48-49页 |
| ·蛋白浓度测定 | 第49-50页 |
| ·结果与讨论 | 第50-54页 |
| ·不同条件下纤维素酶组成型转化子的生长曲线及酶活测定 | 第50-51页 |
| ·组成型表达的纤维素酶的初步纯化 | 第51-52页 |
| ·蛋白比酶活测定 | 第52-54页 |
| 第四章 CBHⅠ吸附结构域纤维单链剥离机制模式的验证 | 第54-78页 |
| ·实验材料 | 第55-56页 |
| ·菌种和质粒 | 第55页 |
| ·培养基和溶液 | 第55-56页 |
| ·实验用到的软件 | 第56页 |
| ·农杆菌介导转化试剂及蛋白表达检测 | 第56页 |
| ·实验方法 | 第56-62页 |
| ·点突变试剂盒原理 | 第56-57页 |
| ·选择性寡聚核糖核苷酸(Selection oligonucleotides) | 第57-58页 |
| ·碱变性 | 第58页 |
| ·杂交反应体系 | 第58-59页 |
| ·合成与连接 | 第59页 |
| ·验证感受态细胞效率 | 第59-60页 |
| ·转化感受态细胞BMH71-18mutS | 第60页 |
| ·转化感受态细胞JM109 | 第60-61页 |
| ·点突变引物设计 | 第61页 |
| ·纤维素酶组成型表达构建及丝状真菌转化方法 | 第61页 |
| ·纤维素酶活测定以及蛋白浓缩及检测方法 | 第61-62页 |
| ·结果讨论 | 第62-78页 |
| ·CBHⅠ吸附结构域模拟 | 第62-65页 |
| ·利用Pymol软件模拟纤维素与CBD结合情况 | 第62-63页 |
| ·计算纤维素链受力情况: | 第63-65页 |
| ·对于确定的潜在位点进行相应的突变研究 | 第65-70页 |
| ·模板DNA的准备 | 第65-67页 |
| ·点突变以及转化BMH71-18mutS | 第67-68页 |
| ·JM109转化子提取质粒 | 第68页 |
| ·pUCMT-cbh1突变子测序结果 | 第68-70页 |
| ·将点突变基因组成型表达元件构建到粗糙脉孢菌中: | 第70-76页 |
| ·将突变的基因构建到含有真菌表达启动子和终止子的载体中去构建真菌表达元件 | 第70-72页 |
| ·构建突变位点的农杆菌转化质粒 | 第72-73页 |
| ·质粒转化农杆菌 | 第73-74页 |
| ·农杆菌转化丝状真菌粗糙脉孢菌 | 第74-76页 |
| ·转化子蛋白性质测定 | 第76-78页 |
| ·蛋白表达 | 第76页 |
| ·转化子蛋白比酶活性质测定 | 第76-78页 |
| 总结与展望 | 第78-79页 |
| 参考文献 | 第79-82页 |
| 致谢 | 第82-83页 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 | 第83页 |
