| 第一章 前言 | 第1-66页 |
| 第一节 嗜热酯酶 APE1547 简介 | 第12-18页 |
| ·嗜热酯酶APE1547的来源及特性 | 第12-13页 |
| ·嗜热酯酶APE1547的结构特点 | 第13-14页 |
| ·嗜热酯酶APE1547的催化机制 | 第14-16页 |
| ·嗜热酶酯APE1547的应用前景 | 第16-18页 |
| 第二节 生物催化反应的手性化学 | 第18-24页 |
| ·生物催化反应的选择性 | 第18-21页 |
| ·生物催化选择性反应的主要类型和机制 | 第21-23页 |
| ·影响生物催化反应的手性化学因素 | 第23页 |
| ·生物催化反应手性化学的应用 | 第23-24页 |
| 第三节 酶结构与立体选择性关系研究 | 第24-30页 |
| ·酶结构稳定的因素 | 第24-26页 |
| ·酶结构与立体选择性关系研究进展 | 第26-30页 |
| 第四节 调节和改善酶催化活性及立体选择性的方法 | 第30-49页 |
| ·酶分子定向进化 | 第31-41页 |
| ·合理设计定点突变酶分子 | 第41-44页 |
| ·物理化学方法 | 第44-49页 |
| 第五节 本论文的研究背景及设计思想 | 第49-54页 |
| ·研究背景 | 第49-51页 |
| ·设计思想 | 第51-54页 |
| 参考文献 | 第54-66页 |
| 第二章 定向进化提高嗜热酯酶 APE1547 的立体选择性 | 第66-104页 |
| 引言 | 第66-67页 |
| 第一节 易错PCR方法构建嗜热酯酶突变库 | 第67-77页 |
| 1 实验材料和方法 | 第67-68页 |
| ·主要仪器 | 第67页 |
| ·主要试剂 | 第67-68页 |
| ·实验菌株 | 第68页 |
| ·实验用质粒 | 第68页 |
| 2 实验方法 | 第68-75页 |
| ·溶液配制 | 第68-69页 |
| ·培养基 | 第69页 |
| ·菌种的复活及扩大培养 | 第69页 |
| ·质粒 DNA 的小量制备 | 第69-70页 |
| ·琼脂糖凝胶中回收 DNA | 第70-71页 |
| ·引物设计 | 第71页 |
| ·易错 PCR 方法建立突变的基因库 | 第71-72页 |
| ·PCR 纯化产物的限制性酶切 | 第72页 |
| ·目的基因的纯化 | 第72页 |
| ·载体 DNA 的限制性酶切纯化及磷酸化处理 | 第72-73页 |
| ·目的基因与载体的连接 | 第73页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第73-74页 |
| ·重组质粒的转化 | 第74-75页 |
| ·单克隆菌体的筛选和鉴定 | 第75页 |
| 3. 结果与讨论 | 第75-77页 |
| ·重组质粒的构建 | 第75-77页 |
| ·突变体酶的分离纯化 | 第77页 |
| 第二节 高通量筛选立体选择性方法的建立 | 第77-89页 |
| 1. 实验材料 | 第78页 |
| ·主要仪器 | 第78页 |
| ·主要试剂 | 第78页 |
| 2. 实验方法 | 第78-82页 |
| ·指示剂的配制 | 第78页 |
| ·底物纯度的测定 | 第78-79页 |
| ·酯酶活力测定 | 第79页 |
| ·嗜热酯酶突变库的建立 | 第79页 |
| ·筛选突变体的活性和立体选择性 | 第79-80页 |
| ·突变体的立体选择性测定 | 第80-82页 |
| 3. 结果与讨论 | 第82-89页 |
| ·高通量筛选方法的可行性研究 | 第82-84页 |
| ·易错 PCR 突变库的筛选 | 第84-86页 |
| ·嗜热酯酶突变体的立体选择性测定 | 第86-88页 |
| ·温度对酶立体选择性的影响 | 第88页 |
| ·突变体结构与立体选择性关系的研究 | 第88-89页 |
| 第三节 DNA shuffling 构建嗜热酯酶突变库 | 第89-94页 |
| 1. 实验材料 | 第89-90页 |
| ·主要仪器 | 第89-90页 |
| ·主要试剂 | 第90页 |
| 2. 实验方法 | 第90-92页 |
| ·重组目的基因的制备 | 第90页 |
| ·DNase1 的消化 | 第90-91页 |
| ·片段自组装 | 第91页 |
| ·PCR 扩增自组装产物 | 第91-92页 |
| 3. 结果与讨论 | 第92-94页 |
| ·DNA 重组突变库的建立 | 第92-93页 |
| ·筛选 DNA 重组突变库的结果 | 第93-94页 |
| 第四节 嗜热酯酶突变体酶学性质的研究 | 第94-97页 |
| 1. 实验材料 | 第95-96页 |
| ·主要仪器 | 第95页 |
| ·主要试剂 | 第95-96页 |
| 2. 实验方法 | 第96-97页 |
| ·酶的大量提取与纯化 | 第96页 |
| ·温度对酶活力的影响 | 第96-97页 |
| ·pH 对酶活力的影响 | 第97页 |
| ·金属离子和表面活性剂对酶活力的影响 | 第97页 |
| 3. 结果与讨论 | 第97-102页 |
| ·突变体最适pH 的测定 | 第97-100页 |
| ·突变体最适温度的测定 | 第100-101页 |
| ·金属离子对酶活的影响 | 第101-102页 |
| 参考文献 | 第102-104页 |
| 第三章 定点突变提高嗜热酯酶 APE1547 的立体选择性 | 第104-126页 |
| 引言 | 第104页 |
| 第一节 计算机软件合理设计筛选底物 | 第104-112页 |
| 1. 实验仪器与材料 | 第105页 |
| ·主要试剂 | 第105页 |
| ·主要仪器 | 第105页 |
| 2. 实验方法 | 第105-106页 |
| ·底物的合成 | 第105-106页 |
| ·底物的纯度测定 | 第106页 |
| ·计算机模拟 | 第106页 |
| ·酶催化乙酸2-辛酯的水解反应 | 第106页 |
| ·转化率和立体选择性测定 | 第106页 |
| 3. 结果与讨论 | 第106-112页 |
| ·底物为苯乙酸2-辛酯的模拟结果 | 第106-110页 |
| ·底物为辛酸2-辛酯的模拟结果 | 第110-111页 |
| ·底物为乙酸2-辛酯的模拟结果 | 第111-112页 |
| 第二节 定点突变提高嗜热酯酶APE1547的立体选择性 | 第112-123页 |
| 1. 实验仪器与材料 | 第112-113页 |
| ·主要试剂 | 第112-113页 |
| ·主要仪器 | 第113页 |
| 2. 实验方法 | 第113-115页 |
| ·引物设计 | 第113页 |
| ·DpnⅠ酶切 | 第113-114页 |
| ·APE1547 突变体菌种的复活及扩大培养 | 第114页 |
| ·质粒DNA 的小量制备(碱裂解法) | 第114页 |
| ·从琼脂糖凝胶中回收 DNA | 第114页 |
| ·PCR反应体系 | 第114页 |
| ·PCR反应条件 | 第114-115页 |
| 3. 结果与讨论 | 第115-123页 |
| ·定点突变的设计思想 | 第115-118页 |
| ·筛选结果及立体选择性的测定 | 第118-119页 |
| ·从结构上分析立体选择性变化原因 | 第119页 |
| ·突变体酶学性质研究 | 第119-123页 |
| 参考文献 | 第123-126页 |
| 第四章 嗜热酯酶 APE1547 立体选择性与结构关系研究 | 第126-140页 |
| 引言 | 第126页 |
| 1. 实验仪器 | 第126-127页 |
| 2. 实验方法 | 第127-128页 |
| ·荧光光谱的测定 | 第127页 |
| ·突变体基因序列确定 | 第127页 |
| ·圆二色谱的测定 | 第127-128页 |
| 3. 结果与讨论 | 第128-138页 |
| ·嗜热酯酶 APE1547 突变体一级结构的变化 | 第128页 |
| ·突变体T826 的研究 | 第128-136页 |
| ·突变体 DT01 与热稳定性的关系 | 第136页 |
| ·突变体 DT02 突变位点与酶活提高的关系 | 第136-137页 |
| ·突变体 DT03 突变位点与立体选择性的关系 | 第137-138页 |
| 参考文献 | 第138-140页 |
| 第五章 丙酮处理嗜热酯酶 APE1547 及突变体 | 第140-158页 |
| 引言 | 第140-142页 |
| 1. 实验仪器与材料 | 第142-143页 |
| ·主要仪器 | 第142-143页 |
| ·主要试剂 | 第143页 |
| 2. 实验方法 | 第143-145页 |
| ·菌体培养 | 第143页 |
| ·酶的纯化与制备 | 第143页 |
| ·丙酮处理冻干酶 | 第143-144页 |
| ·SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第144页 |
| ·镍柱纯化 | 第144页 |
| ·酶活力的测定 | 第144-145页 |
| ·酶催化的乙酸2-辛酯的水解反应 | 第145页 |
| ·底物转化率的测定和2-辛醇的光学纯度测定 | 第145页 |
| ·最适pH 值的测定 | 第145页 |
| ·最适温度的测定 | 第145页 |
| ·测定有机溶剂和表面活性剂对酶活力的影响 | 第145页 |
| 3. 结果与讨论 | 第145-155页 |
| ·嗜热酯酶 APE1547 及突变体的表达与纯化 | 第145-146页 |
| ·丙酮处理酶活力的变化 | 第146-148页 |
| ·丙酮处理酶立体选择性的改变 | 第148-150页 |
| ·丙酮处理酶酶学性质的变化 | 第150-155页 |
| 参考文献 | 第155-158页 |
| 攻读博士期间研究成果 | 第158-160页 |
| 论文摘要(中文) | 第160-164页 |
| 论文摘要(英文) | 第164-168页 |
| 致谢 | 第168-169页 |
| 作者简历 | 第169页 |
