| 目录 | 第1-6页 |
| 摘要 | 第6-7页 |
| ABSTRACT | 第7-8页 |
| 前言 | 第8-27页 |
| 1． 糖生物学研究意义 | 第8-14页 |
| 1．1 寡糖链的重要作用 | 第8-9页 |
| 1．1．1 寡糖链是许多糖缀合物发挥生物功能所必需的 | 第8页 |
| 1．1．2 糖缀合物通过寡糖链的识别作用决定着细胞的识别、集聚及受体作用 | 第8页 |
| 1．1．3 寡糖链的识别作用决定着糖缀合物的组装、转运、消化失活及分类储藏等 | 第8页 |
| 1．1．4 病原细菌在哺乳动物组织细胞靶位上的黏附是感染的关键步骤，大多数微生物在细胞表面的黏附是由糖链介导的 | 第8-9页 |
| 1．2 寡糖链对糖蛋白的作用 | 第9-10页 |
| 1．2．1 蛋白的糖基化影响蛋白质合成时的正确折叠及细胞内定位 | 第9页 |
| 1．2．2 蛋白的糖基化大大增强了蛋白质的体外、体内的稳定性 | 第9页 |
| 1．2．3 糖链在新生肽链折叠过程中的作用 | 第9-10页 |
| 1．2．4 糖链对糖蛋白水溶性的影响 | 第10页 |
| 1．3 糖蛋白的结构 | 第10-11页 |
| 1．3．1 N-连接糖肽 | 第10-11页 |
| 1．3．2 O-连接糖肽 | 第11页 |
| 1．4 糖蛋白的合成 | 第11-13页 |
| 1．4．1 N-糖蛋白的合成 | 第11-13页 |
| 1．4．2 O-糖蛋白的合成 | 第13页 |
| 1．5 糖蛋白的降解 | 第13-14页 |
| 2． N-糖酰胺酶F研究及应用 | 第14-19页 |
| 2．1 N-糖酰胺酶研究现状 | 第14-16页 |
| 2．2 N-糖酰胺酶F的来源、分子结构、功能及其催化的分子机制 | 第16-18页 |
| 2．3 真核细胞中的N-糖酰胺酶 | 第18-19页 |
| 2．4 N-糖酰胺酶:PNGase F与PNG1的比较 | 第19页 |
| 3． 细胞表面表达系统 | 第19-25页 |
| 3．1 酵母细胞表面表达系统介绍 | 第19-20页 |
| 3．2 酵母表面展示系统优点 | 第20-21页 |
| 3．3 酵母细胞壁结构 | 第21-22页 |
| 3．4 酿酒酵母的表面表达原理 | 第22-23页 |
| 3．5 酵母表面展示系统的类型 | 第23-24页 |
| 3．5．1 α凝集素表面展示系统 | 第23页 |
| 3．5．2 a凝集素目的蛋白表面展示系统 | 第23-24页 |
| 3．6 a凝集素目的蛋白表面展示系统研究进展 | 第24页 |
| 3．7 表面展示系统应用 | 第24-25页 |
| 3．7．1 固定化酶 | 第24-25页 |
| 3．7．2 对抗体亲和力进行改造 | 第25页 |
| 3．7．3 生产口服疫苗 | 第25页 |
| 3．7．4 蛋白的定向进化 | 第25页 |
| 4． 本论文的研究目的和意义 | 第25-27页 |
| 4．1 意义 | 第25-26页 |
| 4．2 现状与问题 | 第26页 |
| 4．3 实验目的 | 第26-27页 |
| 实验部分 | 第27-59页 |
| 1． 试验材料 | 第27-29页 |
| 1．1 菌株和质粒 | 第27页 |
| 1．2 分子克隆用酶和试剂 | 第27页 |
| 1．3 培养基 | 第27-28页 |
| 1．4 溶液 | 第28-29页 |
| 1．5 引物 | 第29页 |
| 2． 实验方法 | 第29-39页 |
| 2．1 N-糖酰胺酶F基因在酿酒酵母表面的表达 | 第29-35页 |
| 2．1．1 菌株的活化培养 | 第29-30页 |
| 2．1．2 脑膜炎脓杆菌基因组的提取 | 第30页 |
| 2．1．3 引物合成和目的基因N-糖酰胺酶F的PCR扩增 | 第30-31页 |
| 2．1．4 pYD1质粒的SDS碱裂解法制备 | 第31页 |
| 2．1．5 目的基因片段的回收 | 第31-32页 |
| 2．1．6 目的基因与载体的限制性内切酶消化反应 | 第32页 |
| 2．1．7 目的基因与载体的连接反应 | 第32-33页 |
| 2．1．8 大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第33页 |
| 2．1．9 连接产物的大肠杆菌转化 | 第33页 |
| 2．1．10 重组质粒的制备 | 第33页 |
| 2．1．11 重组质粒的双酶切验证 | 第33-34页 |
| 2．1．12 酵母细胞感受态制备、转化 | 第34页 |
| 2．1．13 酵母中质粒DNA的提取 | 第34页 |
| 2．1．14 重组蛋白的诱导表达 | 第34-35页 |
| 2．2 免疫荧光分析 | 第35页 |
| 2．3 流式细胞仪分析N-糖酰胺酶F细胞表面锚定情况 | 第35-36页 |
| 2．4 N-糖酰胺酶F基因在大肠杆菌中的表达 | 第36-39页 |
| 2．4．1 引物合成和目的基因N-糖酰胺酶的PCR扩增 | 第36页 |
| 2．4．2 pET28a质粒的SDS碱裂解法制备 | 第36页 |
| 2．4．3 目的基因与载体的限制性内切酶消化反应 | 第36-37页 |
| 2．4．4 目的基因与载体的连接反应 | 第37页 |
| 2．4．5 连接产物的大肠杆菌转化 | 第37页 |
| 2．4．6 重组质粒的制备 | 第37页 |
| 2．4．7 重组质粒的双酶切验证 | 第37页 |
| 2．4．8 重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3) | 第37页 |
| 2．4．9 N-糖酰胺酶F在大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达 | 第37-38页 |
| 2．4．10 目的蛋白的大量制备 | 第38页 |
| 2．4．11 包含体的处理 | 第38-39页 |
| 2．4．12 亲和层析纯化N-糖酰胺酶F | 第39页 |
| 2．5 N-糖酰胺酶F脱糖基化作用测定 | 第39页 |
| 2．5．1 SDS-PAGE测定糖蛋白的脱糖基化 | 第39页 |
| 2．5．2 用HPLC分析核糖核酸酶B的脱糖基化 | 第39页 |
| 3． 结果与讨论 | 第39-56页 |
| 3．1 N-糖酰胺酶F基因在酿酒酵母表面的表达 | 第39-44页 |
| 3．1．1 脑膜炎脓杆菌基因组的提取 | 第39-40页 |
| 3．1．2 引物合成和目的基因N-糖酰胺酶F的PCR扩增 | 第40-41页 |
| 3．1．3 目的基因载体pYD1 | 第41-42页 |
| 3．1．4 表达重组子pYD/PNGaseF的构建 | 第42-43页 |
| 3．1．5 酵母中重组质粒提取结果 | 第43-44页 |
| 3．2 N-糖酰胺酶F的表面表达情况的疫荧光分析 | 第44-46页 |
| 3．3 N-糖酰胺酶F的表面表达情况的流式细胞仪分析 | 第46-47页 |
| 3．4 糖酰胺酶F基因在大肠杆菌中的表达 | 第47-51页 |
| 3．4．1 pET28a/PNGaseF重组载体的构建 | 第47-49页 |
| 3．4．2 N-糖酰胺酶F的诱导表达 | 第49-51页 |
| 3．5 N-糖酰胺酶F脱糖基化作用测定 | 第51-56页 |
| 3．5．1 SDS-PAGE测定糖蛋白的脱糖基化 | 第51-55页 |
| 3．5．2 用HPLC分析核糖核酸酶B的脱糖基化 | 第55-56页 |
| 4． 讨论 | 第56-59页 |
| 4．1 表达系统的选择 | 第56-57页 |
| 4．2 诱导条件的选择 | 第57页 |
| 4．3 N-糖酰胺酶F脱糖基化作用 | 第57-59页 |
| 参考文献 | 第59-66页 |
| 致谢 | 第66-67页 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 | 第67页 |
