| 前言 | 第1页 |
| 1 胰岛素样生长因子Ⅰ(huIGF-Ⅰ)研究进展 | 第8-19页 |
| ·huIGF-Ⅰ的发现 | 第8页 |
| ·huIGF-Ⅰ蛋白质结构 | 第8-10页 |
| ·huIGF-Ⅰ基因结构 | 第10页 |
| ·IGF-Ⅰ受体(IGFRI)的结构和功能 | 第10-11页 |
| ·huIGF结合蛋白(IGFBP) | 第11页 |
| ·huIGF-Ⅰ的生物活性调节 | 第11-12页 |
| ·huIGF-Ⅰ的生物学作用 | 第12-13页 |
| ·huIGF-Ⅰ在病理和临床上的研究和应用 | 第13-19页 |
| 2 毕赤氏酵母P.pastoris表达系统研究进展 | 第19-30页 |
| ·甲醇毕赤氏酵母Pichia pastoris的生物学特性 | 第20-21页 |
| ·甲醇毕赤氏酵母Pichia pastoris的遗传学特征 | 第21-24页 |
| ·影响产物表达的因素 | 第24-28页 |
| ·胞内表达和分泌表达 | 第28-29页 |
| ·外源蛋白的糖基化 | 第29-30页 |
| 3 本研究的目的、意义 | 第30-31页 |
| 4 实验技术路线 | 第31-62页 |
| 一、 材料与方法 | 第32-50页 |
| 1 实验材料 | 第32-34页 |
| ·菌种与质粒 | 第32页 |
| ·酶、试剂盒及生化试剂 | 第32-34页 |
| ·仪器 | 第34页 |
| 2 实验方法 | 第34-50页 |
| ·huIGF-Ⅰ基因的克隆和鉴定 | 第34-38页 |
| ·质粒的制备和纯化 | 第34-35页 |
| ·质粒的提取 | 第34页 |
| ·质粒的纯化 | 第34-35页 |
| ·引物设计与基因扩增 | 第35-36页 |
| ·引物设计 | 第35页 |
| ·huIGF-Ⅰ基因的PCR扩增 | 第35-36页 |
| ·huIGF-Ⅰ基因的克隆与测序 | 第36-38页 |
| ·PCR扩增产物的纯化与回收 | 第36页 |
| ·回收产物与T-载体的连接 | 第36-37页 |
| ·E.coli DH5α感受态细胞的制备 | 第37页 |
| ·连接产物的转化 | 第37-38页 |
| ·重组质粒的酶切鉴定 | 第38页 |
| ·huIGF-Ⅰ基因的序列测定 | 第38页 |
| ·酵母表达载体的构建及酵母转化 | 第38-45页 |
| ·表达载体(huIGF-Ⅰ／pGAPZα-A)构建 | 第38-41页 |
| ·酵母转化 | 第41-44页 |
| ·重组菌株PCR扩增鉴定 | 第44-45页 |
| ·重组酵母的摇瓶发酵 | 第45页 |
| ·SDS-PAGE检测和筛选 | 第45-47页 |
| ·阳离子交换柱层析 | 第47页 |
| ·Western blot检测 | 第47-48页 |
| ·生物活性测定 | 第48-50页 |
| 二 结果与分析 | 第50-57页 |
| 1 huIGF-Ⅰ基因的克隆、鉴定和测序 | 第50-51页 |
| ·huIGF-Ⅰ的PCR扩增 | 第50页 |
| ·huIGF-Ⅰ基因克隆载体构建及酶切鉴定 | 第50-51页 |
| ·huIGF-Ⅰ基因的测序鉴定 | 第51页 |
| 2 酵母表达载体的构建 | 第51-52页 |
| ·载体构建 | 第51页 |
| ·Dot blot鉴定 | 第51-52页 |
| 3 酵母的转化和重组酵母的PCR鉴定 | 第52-53页 |
| ·化学转化法最佳条件的确定 | 第52页 |
| ·转化菌株的PCR鉴定 | 第52-53页 |
| 4 发酵液的SDS-PAGE检测和高表达菌株的筛选 | 第53-55页 |
| ·小分子多肽电泳系统的确立 | 第53-54页 |
| ·SDS-PAGE检测和高表达菌株的筛选 | 第54-55页 |
| 5 Western blot检测 | 第55页 |
| 6 阳离子交换柱层析 | 第55-56页 |
| 7 生物活性检测 | 第56-57页 |
| 三、 讨论 | 第57-61页 |
| 1 huIGF-Ⅰ的临床应用和存在问题 | 第57页 |
| 2 pGAPZα-A表达载体的优点 | 第57-58页 |
| 3 酵母表达基因工程产物不均一现象、原因及解决方法 | 第58页 |
| 4 酵母的转化 | 第58页 |
| 5 关于小分子多肽的SDS-PAGE电泳及染色方法 | 第58-59页 |
| 6 来自不同E.coli Top10F′的重组载体表达结果比较 | 第59页 |
| 7 关于MTT比色实验 | 第59-60页 |
| 8 本研究今后的主要研究任务 | 第60-61页 |
| 四、 结论 | 第61-62页 |
| 参考文献 | 第62-67页 |
| 附录 | 第67-68页 |
| 附图 | 第68-69页 |
