| 中文摘要 | 第1-8页 |
| 英文摘要 | 第8-10页 |
| 实验用主要仪器和设备 | 第10-11页 |
| 实验用主要试剂 | 第11-12页 |
| 一、 正文 | 第12-75页 |
| 前言 | 第12-14页 |
| 第一部分 、 人β-神经生长因子重组真核表达载体(pcDNA4-β-NGF)的构建 | 第14-27页 |
| 目的: | 第14-18页 |
| pcDNA4-β-NGF重组质粒构建图 | 第15-16页 |
| pcDNA4B质粒图谱 | 第16-17页 |
| pcDNA4B质粒阅读框 | 第17-18页 |
| 方法和结果: | 第18-27页 |
| 一、 从全血基因组中克隆人β-NGF基因 | 第18页 |
| 二、 以全血基因组DNA为模板，特异性扩增β-NGF基因 | 第18-19页 |
| 三、 PCR产物的提纯 | 第19-20页 |
| 四、 双酶切目的基因和质粒DNA | 第20页 |
| 五、 酶切产物的纯化(同PCR产物的提纯) | 第20页 |
| 六、 酶切后目的基因与载体DNA的体外连接 | 第20-21页 |
| 七、 感受态细胞的制备及质粒的转染(氯化钙法) | 第21-23页 |
| 八、 阳性菌DNA的粗提取 | 第23页 |
| 九、 酶切鉴定重组质粒 | 第23-24页 |
| 十、 计算机自动化基因测序结果 | 第24-26页 |
| 十一、 pcDNA4-β-NGF重组质粒的扩增及纯化 | 第26页 |
| 十二、 总结性电泳 | 第26-27页 |
| 第二部分 、 猫角膜内皮细胞的体外培养及鉴定 | 第27-37页 |
| 目的: | 第27页 |
| 材料和方法: | 第27-28页 |
| 一. 有关试剂的配制 | 第27页 |
| 二. 猫角膜内皮细胞的体外培养 | 第27-28页 |
| 三. 体外培养猫角膜内皮细胞的鉴定: | 第28页 |
| 结果: | 第28-37页 |
| 1 、 形态学观察结果 | 第28-33页 |
| 2 、 NSE的免疫组织化学染色鉴定结果 | 第33-35页 |
| 3 、 透射电镜观察结果 | 第35-37页 |
| 第三部分 、 脂质体介导重组真核表达载体pcDNA4-β-NGF转染体外培养的猫角膜内皮细胞的研究 | 第37-44页 |
| 目的及原理: | 第37页 |
| 方法: | 第37-39页 |
| 一、 紫外分光光度仪检测质粒的纯度并调节其浓度 | 第37页 |
| 二、 脂质体介导外源基因转染培养的猫角膜内皮细胞 | 第37-38页 |
| 三、 报道基因的检测 | 第38页 |
| 四、 RT-PCR法基因水平检测外源基因的表达 | 第38-39页 |
| 五、 免疫组织化学方法蛋白水平检测外源基因的表达 | 第39页 |
| 结果: | 第39-44页 |
| 一、 转染时细胞的形态学变化 | 第39-40页 |
| 二、 转染效率的检测-报道基因的表达结果 | 第40-41页 |
| 三、 细胞总RNA的提取结果 | 第41页 |
| 四、 RT-PCR结果 | 第41-42页 |
| 五、 蛋白水平检测β-NGF的表达-免疫组织化学结果 | 第42-44页 |
| 第四部分 、 人β-NGF基因转染对体外培养的猫角膜内皮细胞分裂再生的影响 | 第44-55页 |
| 目的: | 第44页 |
| 方法: | 第44-46页 |
| 一、 MTT法检测猫角膜内皮细胞增殖活性的原理及方法 | 第44页 |
| 二、 细胞有丝分裂指数分析方法 | 第44-45页 |
| 三、 流式细胞仪检测转基因前后猫角膜内皮细胞中G1细胞比例 | 第45-46页 |
| 四、 人β-NGF基因促进猫角膜内皮细胞定量损伤的制作及测量方法 | 第46页 |
| 结果: | 第46-55页 |
| 一、 MTT法检测猫角膜内皮细胞增殖活性结果 | 第46-48页 |
| 二、 细胞有丝分裂指数分析结果 | 第48-51页 |
| 三、 流式细胞仪检测转基因前后猫角膜内皮细胞的细胞周期结果 | 第51-53页 |
| 四、 人β-NGF基因促进猫角膜内皮细胞定量损伤的愈合结果 | 第53-55页 |
| 第五部分 、 稳定表达人β-NGF基因的猫角膜内皮细胞的筛选 | 第55-70页 |
| 目的: | 第55页 |
| 方法: | 第55页 |
| 一、 角膜内皮细胞的G418最小致死剂量测定方法 | 第55页 |
| 二、 抗性细胞克隆的筛选方法 | 第55页 |
| 三、 人β-NGF单克隆抗体的免疫组织化学染色方法 | 第55页 |
| 结果: | 第55-61页 |
| 一、 角膜内皮细胞G418最小致死剂量测定结果 | 第55页 |
| 二、 抗性细胞克隆的筛选结果 | 第55-58页 |
| 三、 人β-NGF单克隆抗体免疫组织化学染色结果 | 第58-61页 |
| 讨论: | 第61-70页 |
| 参考文献 | 第70-74页 |
| 结论: | 第74-75页 |
| 二、 综述 | 第75-82页 |
| 三、 附录 | 第82-84页 |
| 四、 致谢 | 第84页 |
