| 中文摘要 | 第1-14页 |
| 英文摘要 | 第14-19页 |
| 符号说明 | 第19-22页 |
| 第一部分 小鼠同种移植排斥过程中MIF的表达及意义 | 第22-36页 |
| 一、前言 | 第22-23页 |
| 二、材料与方法 | 第23-28页 |
| (一) 实验材料 | 第23-25页 |
| (二) 实验方法 | 第25-28页 |
| 1.Iodogen法碘化标记抗MIF单克隆抗体 | 第25页 |
| 2.小鼠同种皮肤移植模型的制备 | 第25页 |
| 3.同种皮肤移植物的组织学鉴定 | 第25页 |
| 4.脾细胞悬液制备 | 第25-26页 |
| 5.TRIzol一步法提取组织总RNA | 第26页 |
| 6.RT-PCR | 第26-27页 |
| 7.PCR产物凝胶电泳 | 第27页 |
| 8.PCR产物定量分析 | 第27页 |
| ·I标记抗MIF抗体的动物体内分布 | 第27-28页 |
| 10.统计学分析 | 第28页 |
| 三、实验结果 | 第28-31页 |
| 1 小鼠同种移植物生存率观察 | 第28页 |
| 2.小鼠同种皮肤移植模型的组织学鉴定 | 第28页 |
| 3.移植后不同时间小鼠体内MIF的相对表达量 | 第28-29页 |
| ·I-抗MIF抗体洗脱曲线 | 第29-30页 |
| ·I-抗MIF抗体在正常小鼠体内分布 | 第30页 |
| 6.注射125I-抗MIF抗体后不同时间同种移植小鼠的体内分布 | 第30-31页 |
| 四、讨论 | 第31-36页 |
| 第二部分 MIF在同种移植排斥中的作用及机理研究 | 第36-52页 |
| 一、前言 | 第36-37页 |
| 二、材料和方法 | 第37-43页 |
| (一) 实验材料 | 第37-38页 |
| (二) 实验方法 | 第38-43页 |
| 1.小鼠同种皮肤移植模型的制备 | 第38-39页 |
| 2.制备脾细胞悬液 | 第39页 |
| 3.DTH实验 | 第39页 |
| 4.检测T细胞体外增殖—3H-TdR掺入法 | 第39-40页 |
| 5.T细胞特异性回忆反应—3H-TdR掺入法 | 第40页 |
| 6 同种移植Th1／Th2细胞因子状态—ELISPOT Assay | 第40-41页 |
| 7.IL-2及IL-4含量测定—放射免疫分析 | 第41页 |
| 8.T细胞特异性杀伤活性—JAM Assay | 第41-42页 |
| 9.淋巴细胞表面FasL检测—流式细胞分析 | 第42页 |
| 10.NK细胞杀伤活性测定—MTT掺入法 | 第42-43页 |
| 11.巨噬细胞表面标志CD11b(Mac-1)—流式细胞分析 | 第43页 |
| 12.统计学分析 | 第43页 |
| 三、实验结果 | 第43-47页 |
| 1.体内注射抗MIF抗体对同种移植物生存率的影响 | 第43-44页 |
| 2.体内注射抗MIF抗体对DTH的影响 | 第44页 |
| 3.MIF对正常B6小鼠混合淋巴细胞反应的影响 | 第44页 |
| 4.MIF对移植排斥过程中T细胞增殖的影响 | 第44页 |
| 5.MIF对Th1／Th2细胞因子分泌的影响 | 第44-45页 |
| 1) 同种移植Th1／Th2细胞因子状态 | 第44页 |
| 2) MIF对IL-2产生的影响 | 第44页 |
| 3) MIF对IL-4产生的影响 | 第44-45页 |
| 6.抗MIF抗体对T细胞特异性回忆反应的影响 | 第45页 |
| 7.抗MIF抗体对T细胞特异性杀伤活性影响 | 第45-46页 |
| 8.脾细胞表面的FasL表达情况 | 第46页 |
| 9.抗MIF抗体对NK细胞杀伤活性的影响 | 第46页 |
| 10.MIF对巨噬细胞表面标志CD11b(Mac-1)的影响 | 第46-47页 |
| 四、讨论 | 第47-52页 |
| 第三部分 间接识别途径中抗MIF抗体对同种移植物排斥的影响机理研究 | 第52-59页 |
| 一、前言 | 第52-53页 |
| 二、实验材料与方法 | 第53-55页 |
| 1.实验动物 | 第53页 |
| 2.小鼠同种皮肤移植间接识别模型的制备 | 第53页 |
| 3.单克隆抗体 | 第53页 |
| 4.DTH实验 | 第53页 |
| 5.T细胞亚群分离 | 第53-54页 |
| 6.ELISPOT Assay | 第54页 |
| 7.组织学及免疫组化分析 | 第54页 |
| 8.统计学分析 | 第54-55页 |
| 三、实验结果 | 第55-56页 |
| 1.体内阻断MIF对间接途径中同种皮肤移植物的生存率影响 | 第55页 |
| 2.抗MIF抗体对DTH的影响 | 第55页 |
| 3.抗MIF抗体对细胞因子IFNg／IL-2产生的影响 | 第55页 |
| 4.抗MIF抗体对小鼠同种移植物中细胞浸润的影响 | 第55-56页 |
| 四、讨论 | 第56-59页 |
| 第四部分 小鼠MIF基因克隆和重组表达 | 第59-79页 |
| 前言 | 第59-60页 |
| Ⅰ 小鼠MIF的基因克隆 | 第60-69页 |
| 一、材料和方法 | 第60-67页 |
| 二、实验结果 | 第67-69页 |
| 1.小鼠MIF基因序列特异引物的设计 | 第67页 |
| 2.组织总RNA的制备 | 第67页 |
| 3.RT-PCR实验条件的探讨 | 第67页 |
| 4.PCR产物的回收纯化 | 第67-68页 |
| 5.MIFcDNA序列测定 | 第68-69页 |
| Ⅱ 小鼠MIF基因在大肠杆菌M15中的表达 | 第69-77页 |
| 一、材料与方法 | 第69-74页 |
| (一) 实验材料 | 第69-71页 |
| (二) 实验方法 | 第71-74页 |
| 1.重组表达载体的构建 | 第71-72页 |
| 2.MIF重组表达质粒的转化 | 第72-73页 |
| 3.蛋白质的诱导表达 | 第73页 |
| 4.蛋白质的SDS-PAGE | 第73页 |
| 5.Western Blot分析表达产物 | 第73-74页 |
| 6.不同诱导条件下MIF表达的检测 | 第74页 |
| 二、实验结果 | 第74-77页 |
| 1.空质粒的制备及纯化 | 第75页 |
| 2.粘末端目的基因片断的制备及纯化 | 第75页 |
| 3.MIF重组表达载体的构建 | 第75页 |
| 4.阳性转化子的筛选 | 第75-76页 |
| 5.SDS-PAGE分析 | 第76页 |
| 6.Western Blot分析表达产物 | 第76页 |
| 7.最佳诱导条件的探讨 | 第76-77页 |
| Ⅲ 蛋白质的纯化 | 第77-78页 |
| 一、材料与方法 | 第77-78页 |
| (一) 实验材料 | 第77页 |
| (二) 实验方法 | 第77-78页 |
| 1.确定表达蛋白的可溶性 | 第77-78页 |
| 2.提纯蛋白 | 第78页 |
| 二、实验结果 | 第78页 |
| 1.目的蛋白在大肠杆菌中存在的形式 | 第78页 |
| 2 提纯蛋白 | 第78页 |
| Ⅵ 重组MIF蛋白生物学活性测定 | 第78-79页 |
| 一、材料与方法 | 第78-79页 |
| (一) 实验材料 | 第78-79页 |
| (二) 实验方法：巨噬细胞移动抑制试验 | 第79页 |
| 二、实验结果 | 第79页 |
| 讨论 | 第79-83页 |
| 附图表 | 第83-110页 |
| 参考文献 | 第110-117页 |
| 文献综述 | 第117-129页 |
| 致谢 | 第129-130页 |
| 在学期间发表论文 | 第130-131页 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 | 第131页 |
