| 摘要 | 第1-16页 |
| Summary | 第16-19页 |
| 第一章 文献综述 | 第19-42页 |
| 第一部分 紫杉醇生物合成的分子生物学 | 第19-36页 |
| 第一节 紫杉醇生物合成上游途径的分子生物学和生物化学 | 第20-30页 |
| 1 萜类在细胞质中通过MVA途径生物合成 | 第22页 |
| 2 萜类在质体中通过DXP途径生物合成 | 第22-23页 |
| 3 MVA途径上的基因和酶 | 第23-26页 |
| 4 DXP途径上的基因和酶 | 第26-29页 |
| 5 MVA途径和DXP途径之间的交流 | 第29-30页 |
| 第二节 紫杉醇生物合成下游途径的分子生物学和生物化学 | 第30-35页 |
| 1 紫杉醇20碳前体骨架GGPP的生物合成 | 第30-31页 |
| 2 紫杉二烯合成酶催化GGPP环化生成紫杉二烯 | 第31-32页 |
| 3 紫杉二烯官能化过程中涉及到的酶和基因 | 第32-35页 |
| 第三节 紫杉醇生物合成分子生物学小结 | 第35-36页 |
| 第二部分 抗癌萜类吲哚生物碱的代谢工程 | 第36-42页 |
| 1 TIAs生物合成上游途径中的关键酶TDC、G10H和STR及其应用 | 第37-39页 |
| 2 长春花TIAs生物合成代谢全局转录调控因子ORCA3及其应用 | 第39-42页 |
| 第二章 材料与方法 | 第42-92页 |
| 第一部分 紫杉醇前体生物合成途径的分子生物学 | 第42-79页 |
| 1 植物材料 | 第42页 |
| 2 菌株和表达载体 | 第42页 |
| 3 仪器和设备 | 第42-43页 |
| 4 试剂盒及购买的试剂 | 第43-44页 |
| 5 自配的主要标准试剂 | 第44-45页 |
| 6 自配的其它试剂 | 第45页 |
| 7 方法与步骤 | 第45-79页 |
| ·曼地亚红豆杉材料的准备 | 第45页 |
| ·曼地亚红豆杉细胞的诱导处理 | 第45页 |
| ·诱导处理曼地亚红豆杉细胞RNA的抽提 | 第45-46页 |
| ·从成熟的曼地亚红豆杉组织中提取高质量RNA | 第46页 |
| ·曼地亚红豆杉DNA的提取 | 第46-47页 |
| ·曼地亚红豆杉基因组步移DNA库的构建 | 第47-48页 |
| ·从曼地亚红豆杉总RNA合成第一链cDNA | 第48-49页 |
| ·方案一:使用Invitrogen公司的3’RACE试剂盒进行反转 | 第48-49页 |
| ·方案二:使用Clontech公司的反转录试剂盒进行反转 | 第49页 |
| ·目的基因克隆 | 第49-63页 |
| ·tmhmgr，tmfps，tmipi，tmdxs，tmdxr基因核心片段的获得 | 第49-50页 |
| ·tmggpps基因的基因组核心片段获得 | 第50-51页 |
| ·曼地亚红豆杉RACE-Ready cDNA的合成 | 第51页 |
| ·tmhmgr的的克隆 | 第51-55页 |
| ·tmfps，tmipi，tmdxs，tmdxr的克隆 | 第55-58页 |
| ·tmggpps的克隆 | 第58-63页 |
| ·tmggpps的3’和5’RACE | 第58页 |
| ·tmggpps全长cDNA的克隆 | 第58-59页 |
| ·tmggpps基因启动子序列的克隆-5’walking | 第59-62页 |
| ·tmggpps基因终止子序列的克隆-3’walking | 第62-63页 |
| ·含启动子和终止子序列的tmggpps全长基因的扩增 | 第63页 |
| ·Southern blot分析 | 第63-68页 |
| ·试剂配制 | 第63-64页 |
| ·探针的制备 | 第64页 |
| ·探针的标记 | 第64-65页 |
| ·曼地亚红豆杉基因组DNA的限制性酶切消化 | 第65-66页 |
| ·Southern blot凝胶电泳 | 第66页 |
| ·Southern blot凝胶转膜和固定 | 第66页 |
| ·探针与尼龙膜的Southern blot杂交和检测 | 第66-67页 |
| ·封阻、抗体温育和洗膜 | 第67页 |
| ·自显影 | 第67-68页 |
| ·基因表达分析 | 第68-69页 |
| ·Northern blot分析 | 第68-69页 |
| ·探针的制备 | 第68页 |
| ·配制琼脂糖甲醛变性凝胶 | 第68页 |
| ·RNA变性样品的制备和电泳 | 第68页 |
| ·Northern blot凝胶转膜、固定和杂交检测 | 第68-69页 |
| ·RT-PCR分析 | 第69页 |
| ·亚克隆、测序 | 第69-72页 |
| ·凝胶电泳 | 第69页 |
| ·凝胶电泳条带或酶切产物的柱层析回收 | 第69-70页 |
| ·大肠杆菌DH5α和XL1-Blue感受态的制备 | 第70页 |
| ·DNA回收片段与pGEM-T Easy Vector载体的连接 | 第70-71页 |
| ·DNA与pGEM-T Easy Vector的连接产物转化DH5α感受态细胞 | 第71页 |
| ·转化重组载体后的DH5α单菌落培养和质粒的提取 | 第71-72页 |
| ·引物合成、转化重组子的鉴定、测序 | 第72页 |
| ·生物信息学分析 | 第72页 |
| ·基因的功能验证 | 第72-79页 |
| ·tmhmgr基因在HMGR缺陷型酵母突变体JRY2394中的功能验证 | 第72-75页 |
| ·tmhmgr编码区的克隆 | 第73-74页 |
| ·tmhmgr编码区克隆到酵母表达载体pYES2 | 第74页 |
| ·醋酸锂法转化酵母JRY2394 | 第74-75页 |
| ·JRY2394转化子的筛选 | 第75页 |
| ·JRY2394，JRY2394+pYES2，JRY2394+pYES2+tmhmgr生长情况比较 | 第75页 |
| ·tmfps基因在FPS缺陷型酵母突变体中的功能验证 | 第75-76页 |
| ·tmfps编码区的克隆 | 第75页 |
| ·tmhmgr编码区克隆到酵母表达载体pYES2 | 第75-76页 |
| ·醋酸锂法转化酵母CC25 | 第76页 |
| ·CC25转化子的筛选 | 第76页 |
| ·CC25和CC25+tmfps生长情况比较 | 第76页 |
| ·tmggpps基因在酵母突变体SFNY368中的功能验证 | 第76-77页 |
| ·tmggpps编码区的克隆 | 第76页 |
| ·tmggpps编码区克隆到酵母表达载体pYES2.1 TOPO | 第76页 |
| ·醋酸锂法转化酵母SFNY368 | 第76-77页 |
| ·SFNY368转化子的筛选 | 第77页 |
| ·SFNY368，SFNY368+tmggpps和NY180生长情况比较 | 第77页 |
| ·tmipi基因的功能验证 | 第77-79页 |
| ·tmipi功能验证中用到的质粒:pAC-BETA和pTrcAtIPI | 第77-79页 |
| ·带酶切位点的tmipi编码区的克隆 | 第79页 |
| ·tmipi表达载体的构建 | 第79页 |
| ·携带不同质粒的XL1-Blue生长情况比较 | 第79页 |
| 第二部分 抗癌萜类吲哚生物碱的代谢工程 | 第79-92页 |
| 1 喜树TIAs的代谢工程 | 第79-88页 |
| ·植物材料 | 第79页 |
| ·长春花tdc、g10h、str和orca3基因编码区的克隆 | 第79-80页 |
| ·长春花RNA的提取 | 第79-80页 |
| ·长春花cDNA第一链的合成 | 第80页 |
| ·长春花tdc、g10h、str和orca3基因编码区的克隆 | 第80页 |
| ·植物表达载体pCAMBIA1304~++str+tdc的构建 | 第80-84页 |
| ·pCAMBIA1304~+的构建 | 第80-81页 |
| ·植物表达载体pCAMBIA1304~++tdc+str的构建 | 第81-84页 |
| ·农杆菌C58C1和LBA4404的转化 | 第84页 |
| ·农杆菌感受态的制备 | 第84页 |
| ·农杆菌的工程菌株的获得 | 第84页 |
| ·根癌农杆菌LBA4404介导p1304~++str+tdc遗传转化喜树 | 第84-85页 |
| ·喜树无菌苗的培养 | 第85页 |
| ·农杆菌的培养 | 第85页 |
| ·共培养 | 第85页 |
| ·转基因喜树愈伤组织的诱导和培养 | 第85页 |
| ·喜树潮霉素抗性愈伤组织的培养 | 第85页 |
| ·转基因喜树PCR和RT-PCR检测 | 第85-87页 |
| ·喜树愈伤组织DNA和RNA的提取 | 第85页 |
| ·喜树愈伤组织DNA的提取 | 第85-86页 |
| ·喜树愈伤组织RNA的提取 | 第86页 |
| ·PCR检测目的基因 | 第86页 |
| ·RT-PCR检测目的基因的表达 | 第86-87页 |
| ·喜树碱和羟基喜树碱含量测定 | 第87-88页 |
| ·仪器与试药 | 第87页 |
| ·色谱条件及系统适用性 | 第87页 |
| ·线性关系 | 第87页 |
| ·样品测定方法 | 第87-88页 |
| ·精密度试验 | 第88页 |
| ·重复性试验 | 第88页 |
| ·稳定性试验 | 第88页 |
| ·回收率测定 | 第88页 |
| 2 长春花抗癌萜类吲哚生物碱代谢工程的基础工作 | 第88-92页 |
| ·植物表达载体pCAMBIA1304~++g10h、pCAMBIA1304~++orca3、pCAMBIA1304~++g10h+orca3的构建 | 第88-90页 |
| ·pCAMBIA1304~++g10h的构建 | 第88-89页 |
| ·植物表达载体pCAMBIA1304~++orca3的构建 | 第89-90页 |
| ·植物表达载体pCAMBIA1304~++g10h+Orca3的构建 | 第90页 |
| ·质粒转化农杆菌C58C1和LBA4404 | 第90页 |
| ·农杆菌感受态的制备 | 第90页 |
| ·农杆菌的工程菌株的获得 | 第90页 |
| ·根癌农杆菌C58C1(disarmed and harboring pRiA4)介导pCAMBIA1304~++g10h、pCAMBIA1304~++orca3、pCAMBIA1304~+g10h+orca3遗传转化长春花 | 第90-91页 |
| ·无菌苗的培养 | 第90页 |
| ·农杆菌的培养 | 第90-91页 |
| ·共培养 | 第91页 |
| ·毛状根的诱导和培养 | 第91页 |
| ·长春花转基因毛状根PCR和RT-PCR检测 | 第91-92页 |
| ·长春花毛状根DNA和RNA的提取 | 第91页 |
| ·PCR检测目的基因 | 第91页 |
| ·RT-PCR检测目的基因的表达 | 第91-92页 |
| 第三章 结果和讨论 | 第92-158页 |
| 第一部分 紫杉醇前体生物合成的分子生物学 | 第92-145页 |
| 1 建立从成熟的红豆杉组织中提取高质量RNA的方法 | 第92-94页 |
| 2 紫杉醇生物合成上游途径中重要基因的克隆、分析和功能验证 | 第94-145页 |
| ·紫杉醇生物合成MVA途径上重要基因的克隆、分析与功能鉴定 | 第94-120页 |
| ·曼地亚红豆杉3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(TmHMGR) | 第94-103页 |
| ·tmhmgr全长cDNA的分子克隆 | 第95-96页 |
| ·TmHMGR的生物信息学分析 | 第96-100页 |
| ·tmhmgr在酵母中的功能互补 | 第100-101页 |
| ·Southern和Northern杂交分析 | 第101-103页 |
| ·tmhmgr研究小结 | 第103页 |
| ·曼地亚红豆杉法尼基二磷酸合成酶(TmFPS) | 第103-112页 |
| ·tmfps全长cDNA的分子克隆 | 第104-105页 |
| ·TmFPS的生物信息学分析 | 第105-109页 |
| ·tmfps在酵母中的功能互补 | 第109-110页 |
| ·Southern和Northern杂交分析 | 第110-111页 |
| ·tmfps基因研究小结 | 第111-112页 |
| ·曼地亚红豆杉异戊烯二磷酸:二甲基丙烯基二磷酸异构酶(TmIPI) | 第112-120页 |
| ·tmipi全长cDNA的分子克隆 | 第112-113页 |
| ·TmIPI的生物信息学分析 | 第113-117页 |
| ·tmipi的功能验证 | 第117-119页 |
| ·Southern杂交分析 | 第119页 |
| ·tmipi研究小结 | 第119-120页 |
| ·紫杉醇生物合成DXP途径上限速酶基因dxs和dxr的克隆与分析 | 第120-137页 |
| ·曼地亚红豆杉1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(TmDXS):紫杉醇生物合成DXP途径上第一个限速酶 | 第121-130页 |
| ·tmdxs全长cDNA的分子克隆 | 第121-123页 |
| ·TmDXS的生物信息学分析 | 第123-128页 |
| ·tmdxs的Southern和表达分析 | 第128-129页 |
| ·tmdxs研究的小结 | 第129-130页 |
| ·曼地亚红豆杉1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(TmDXR):紫杉醇生物合成DXP途径上第二个限速酶 | 第130-137页 |
| ·tmdxr全长cDNA的分子克隆 | 第130-131页 |
| ·TmDXR的生物信息学分析 | 第131-137页 |
| ·tmdxr研究小结 | 第137页 |
| ·合成紫杉醇20碳二萜骨架的香叶基香叶基二磷酸合成酶(TmGGPPs) | 第137-145页 |
| ·tmggpps基因组序列和全长cDNA的分子克隆 | 第138-139页 |
| ·tmggpps基因组序列的分子克隆 | 第138页 |
| ·tmggpps全长cDNA的分子克隆 | 第138-139页 |
| ·TmGGPPS的生物信息学分析 | 第139-142页 |
| ·tmggpps在酵母中的功能互补验证 | 第142-143页 |
| ·MeJA处理曼地亚红豆杉细胞后tmggpps的表达 | 第143-144页 |
| ·tmggpps研究小结 | 第144-145页 |
| 第二部分 抗癌萜类吲哚生物碱的代谢工程 | 第145-158页 |
| 1 喜树TIAs的代谢工程 | 第145-152页 |
| ·中间载体p1304~+的构建 | 第146页 |
| ·带相应粘性末端酶切位点的目的基因编码区的扩增 | 第146-147页 |
| ·目的基因植物高效表达载体p1304~++str+tdc的构建 | 第147-148页 |
| ·农杆菌介导p1304~++str+tdc遗传转化喜树 | 第148-149页 |
| ·喜树转长春花tdc和str基因的PCR和RT-PCR检测 | 第149-150页 |
| ·喜树愈伤组织羟基喜树和喜树碱含量测定 | 第150-152页 |
| 2 长春花TIAs代谢工程基础工作 | 第152-158页 |
| ·目的基因植物表达载体p1304~++g10h，p1304~++orca3，p1304~++g10h+orca3的构建 | 第152-155页 |
| ·C58C1介导p1304~++g10h，p1304~++orca3，p1304~++g10h+orca3对长春花的遗传转化 | 第155页 |
| ·长春花毛状根的继代培养 | 第155-156页 |
| ·长春花转基因毛状根的PCR和RT-PCR检测 | 第156-157页 |
| ·小结 | 第157-158页 |
| 参考文献 | 第158-173页 |
| 攻读博士学位期间发表的SCI论文 | 第173-175页 |
| 致谢 | 第175-177页 |
