| 中文摘要 | 第1-11页 |
| 英文摘要 | 第11-15页 |
| 前言 | 第15-22页 |
| 第一部分 反转录病毒载体介导的携带位点控制区中单个或多个DNaseI高敏位点核心序列的人β-珠蛋白基因在鼠红系细胞中的整合与表达 | 第22-60页 |
| 材料与方法 | 第22-38页 |
| 一、实验材料 | 第22-23页 |
| 1.菌株与质粒 | 第22页 |
| 2.细胞系 | 第22页 |
| 3.限制性内切酶及修饰酶 | 第22-23页 |
| 4.其它主要试剂 | 第23页 |
| 5.主要仪器 | 第23页 |
| 6.放射性核素 | 第23页 |
| 二、实验方法 | 第23-38页 |
| 1.反转录病毒载体介导人β-珠蛋白基因转移的基本路线 | 第23-24页 |
| 2.人β-珠蛋白基因反转录病毒载体的设计与构建 | 第24-29页 |
| ·PCR扩增人β-LCR／HS3,HS1核心序列 | 第25-26页 |
| ·聚乙二醇(PEG)法回收DNA片段 | 第26页 |
| ·DNA片段3’端凹陷的补平 | 第26页 |
| ·DNA片段3’端突出的削平 | 第26页 |
| ·载体的脱磷酸化 | 第26-27页 |
| ·连接反应 | 第27页 |
| ·感受态大肠杆菌细胞制备 | 第27页 |
| ·感受态细胞的转化 | 第27-28页 |
| ·质粒DNA的小量制备 | 第28页 |
| ·质粒DNA的大量制备 | 第28页 |
| ·荧光测序 | 第28-29页 |
| 3 | 第29-30页 |
| ·细胞培养 | 第29页 |
| ·G418溶液配制 | 第29页 |
| ·细胞传代及冻存 | 第29页 |
| ·细胞复苏 | 第29-30页 |
| 4.产病毒细胞系的建立 | 第30-31页 |
| ·β-珠蛋白基因反转录重组体转染单向性包装细胞Ψ-E | 第30页 |
| ·Ψ-E细胞出芽的病毒颗粒转导PA317细胞 | 第30-31页 |
| ·PA317产病毒细胞系的扩增、冻存及病毒上清收集 | 第31页 |
| ·病毒滴度的测定 | 第31页 |
| 5.前病毒DNA结构分析 | 第31-34页 |
| ·从产病毒细胞系及感染细胞中提取基因组DNA | 第31-32页 |
| ·Southern印迹分析 | 第32-34页 |
| ·酶解 | 第32页 |
| ·电泳 | 第32页 |
| ·Southern转移 | 第32-33页 |
| ·预杂交 | 第33页 |
| ·DNA探针标记 | 第33-34页 |
| ·杂交 | 第34页 |
| ·洗膜及放射自显影 | 第34页 |
| 6.β-珠蛋白基因反转录病毒转导MEL细胞 | 第34页 |
| ·收集病毒上清 | 第34页 |
| ·病毒转导MEL细胞的程序 | 第34页 |
| 7.DMSO／Hemin诱导MEL细胞分化 | 第34-35页 |
| 8.RNase保护实验检测人β-珠蛋白基因的表达水平 | 第35-38页 |
| ·从病毒转导MEL细胞中提取细胞总RNA | 第35页 |
| ·RNA保护实验 | 第35-38页 |
| ·RNA探针标记 | 第35-36页 |
| ·RNA探针的纯化 | 第36页 |
| ·RNA：RNA杂交 | 第36页 |
| ·RNase反应、变性胶电泳及放射性自显影 | 第36-38页 |
| 实验结果 | 第38-60页 |
| 一、β-珠蛋白基因反转录病毒载体的构建 | 第38-52页 |
| 1.微小位点控制区的构建 | 第38-43页 |
| ·位点控制区DNaseI高敏位点核心序列片段的选择 | 第38页 |
| ·微小位点控制区的构建 | 第38-43页 |
| 2.β-珠蛋白基因的修饰 | 第43-45页 |
| ·β-珠蛋白基因第二内含子(IVS-Ⅱ)的RsaI／RsaI序列的删除 | 第43页 |
| ·2.7kb △β2.7基因片段的构建 | 第43页 |
| ·2.0kb △β2.0基因片段的构建 | 第43-45页 |
| 3.β-珠蛋白基因反转录病毒载体的构建 | 第45-52页 |
| ·携带单个HS2片段的β-珠蛋白基因反转录病毒载体的构建 | 第45-46页 |
| ·携带miniLCR(HS432)的β-珠蛋白基因反转录病毒载体的构建 | 第46-50页 |
| ·携带miniLCR(HS4321)的β-珠蛋白基因反转录病毒载体的构建 | 第50-52页 |
| 二、产β-珠蛋白基因反转录病毒细胞系的建立 | 第52-54页 |
| 1.PA317细胞克隆中的前病毒DNA结构 | 第52-54页 |
| 2.PA317产病毒细胞系的滴度 | 第54页 |
| 三、β-珠蛋白基因反转录病毒载体在病毒转导MEL细胞中整合 | 第54-58页 |
| 四、β-珠蛋白基因在病毒转导MEL细胞中的表达 | 第58-60页 |
| 第二部分 腺相关病毒载体介导的携带位点控制区中单个或多个DNaseI高敏位点核心序列的人β-珠蛋白基因在鼠红系细胞中整合与表达 | 第60-77页 |
| 材料与方法： | 第60-66页 |
| 一、实验材料 | 第60页 |
| 二、实验方法 | 第60-66页 |
| 1.腺相关病毒载体介导人β-珠蛋白基因转移的基本路线 | 第60-61页 |
| 2.人β-珠蛋白基因腺相关病毒载体的设计与构建 | 第61-63页 |
| ·PCR扩增人β-LCR／HS3,HS1核心序列 | 第62页 |
| ·聚乙二醇法回收DNA片段 | 第62页 |
| ·DNA片段3’端凹陷的补平 | 第62页 |
| ·DNA片段3’端突出的削平 | 第62页 |
| ·载体的脱磷酸化 | 第62-63页 |
| ·连接反应 | 第63页 |
| ·感受态大肠杆菌细胞制备 | 第63页 |
| ·感受态细胞转化 | 第63页 |
| ·质粒DNA的小量制备 | 第63页 |
| ·质粒DNA的大量制备 | 第63页 |
| ·荧光测序 | 第63页 |
| 3 | 第63页 |
| ·细胞培养 | 第63页 |
| ·G418溶液配制 | 第63页 |
| ·细胞传代及冻存 | 第63页 |
| ·细胞复苏 | 第63页 |
| 4.β-珠蛋白基因腺相关病毒载体的包装及滴度测定 | 第63-64页 |
| ·β-珠蛋白基因腺相关病毒载体的包装 | 第63-64页 |
| ·病毒滴度的测定 | 第64页 |
| 5.β-珠蛋白基因腺相关病毒转导MEL细胞 | 第64-65页 |
| 6.β-珠蛋白基因腺相关病毒DNA结构的分析 | 第65页 |
| ·从病毒转导细胞中提取基因组DNA | 第65页 |
| ·Southern印迹分析 | 第65页 |
| 7.DMSO／Hemin诱导MEL细胞分化 | 第65页 |
| 8.RNase保护实验检测人β-珠蛋白基因的表达水平 | 第65-66页 |
| 实验结果 | 第66-77页 |
| 一、β-珠蛋白基因腺相关病毒载体的构建 | 第66-70页 |
| 1.携带单个HS2片段的β-珠蛋白基因腺相关病毒载体的构建 | 第66页 |
| 2.携带miniLCR的β-珠蛋白基因腺相关病毒载体的构建 | 第66-70页 |
| 二、β-珠蛋白基因腺相关病毒载体的包装 | 第70页 |
| 三、β-珠蛋白基因腺相关病毒载体在病毒转导细胞中的整合 | 第70-75页 |
| 四、β-珠蛋白基因在病毒转导MEL细胞中的表达 | 第75-77页 |
| 讨论 | 第77-84页 |
| 小结 | 第84-85页 |
| 参考文献 | 第85-94页 |
| 文献综述 | 第94-124页 |
| 参考文献 | 第116-124页 |
| 英文名词及缩写 | 第124-127页 |
| 致谢 | 第127页 |
