| 摘要 | 第1-6页 |
| ABSTRACT | 第6-12页 |
| 1.前言 | 第12-15页 |
| 2.材料与方法 | 第15-30页 |
| ·材料 | 第15-17页 |
| ·引物合成及序列测定 | 第15页 |
| ·菌株、细胞株 | 第15页 |
| ·质粒 | 第15页 |
| ·分子生物学工具酶 | 第15页 |
| ·常用分子生物学试剂盒 | 第15-16页 |
| ·细胞培养试剂 | 第16页 |
| ·抗体 | 第16页 |
| ·其它试剂 | 第16页 |
| ·大型仪器 | 第16-17页 |
| ·方法 | 第17-30页 |
| ·载体的构建与鉴定 | 第17-18页 |
| ·PCR扩增目的片段 | 第17页 |
| ·酶切PCR产物和载体 | 第17页 |
| ·连接 | 第17-18页 |
| ·转化 | 第18页 |
| ·重组子的筛选 | 第18页 |
| ·测序 | 第18页 |
| ·哺乳动物细胞的转染 | 第18-19页 |
| ·Western Blot分析 | 第19页 |
| ·Northern Blot分析 | 第19-20页 |
| ·细胞中总RNA的提取及RT-PCR | 第20-21页 |
| ·蛋白的胞内定位检测 | 第21页 |
| ·HP信号肽氨基酸序列测定 | 第21-22页 |
| ·GST融合蛋白在大肠杆菌中的表达与纯化 | 第22页 |
| ·His融合蛋白的诱导表达与纯化 | 第22-23页 |
| ·HP多克隆抗体的制备 | 第23页 |
| ·免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP) | 第23-24页 |
| ·GST沉淀(pull-down)分析 | 第24页 |
| ·HP转录活性的测定 | 第24-25页 |
| ·SiRNAs表达载体的构建 | 第25-27页 |
| ·筛选稳定转染细胞株及单克隆化鉴定 | 第27-28页 |
| ·细胞生长情况鉴定 | 第28页 |
| ·细胞周期分析 | 第28-29页 |
| ·细胞集落形成检测 | 第29-30页 |
| 3.结果 | 第30-65页 |
| ·HP基因及其表达蛋白性质的初探 | 第30-44页 |
| ·新基因Hp的克隆 | 第30-34页 |
| ·HP的生物信息学分析 | 第34-35页 |
| ·HP在哺乳动物细胞中的表达及定位 | 第35-37页 |
| ·HP在哺乳动物细胞中的表达 | 第35页 |
| ·内源性HP的转录 | 第35-36页 |
| ·HPmRNA在乳腺肿瘤细胞中的表达 | 第36页 |
| ·HP的细胞内定位 | 第36-37页 |
| ·HP信号肽序列分析 | 第37-39页 |
| ·HP(1-800aa)FLAG表达载体的构建 | 第37-38页 |
| ·HP(1-800aa)重组质粒的酶切鉴定 | 第38页 |
| ·重组质粒的表达鉴定 | 第38-39页 |
| ·氨基酸序列分析 | 第39页 |
| ·HP抗体 | 第39-44页 |
| ·HP缺失突变体GST表达载体 | 第40-41页 |
| ·HP缺失突变体His表达载体 | 第41-42页 |
| ·HP缺失突变体GST/His重组质粒的诱导表达与蛋白纯化 | 第42-43页 |
| ·HP抗体的检测 | 第43-44页 |
| ·HP与Smad4存在相互作用 | 第44-45页 |
| ·HP与Smad4在酵母细胞中存在相互作用 | 第44页 |
| ·HP与Smad4在体内外的相互作用 | 第44-45页 |
| ·HP与Smad4在体内的相互作用 | 第44-45页 |
| ·HP与Smad4在体外的相互作用 | 第45页 |
| ·HP的转录调节活性 | 第45-50页 |
| ·HP及突变体能抑制3TP-lux报告基因转录活性 | 第45-46页 |
| ·HP调节TGF-β应答的报告基因转录活性 | 第46-48页 |
| ·HP-siRNA对HP转录调节活性的影响 | 第48-49页 |
| ·HP-siRNA靶序列测序分析 | 第48页 |
| ·HP-siRNA对外源HP基因表达的影响 | 第48-49页 |
| ·HP-SiRNA表达抑制TGF-β应答的报告基因的转录 | 第49页 |
| ·HP调节ER应答的报告基因的转录活性 | 第49-50页 |
| ·HP的蛋白表达调节活性 | 第50-54页 |
| ·HP在MCF-7细胞中过量表达 | 第50-51页 |
| ·HP调节Smad4信号转导相关蛋白的表达 | 第51页 |
| ·HP调节TGF-β靶基因的表达 | 第51-52页 |
| ·HP调节信号下游蛋白的表达 | 第52-53页 |
| ·HP调节细胞周期蛋白的表达 | 第53-54页 |
| ·HP的细胞学功能 | 第54-63页 |
| ·HP过量表达调节细胞的生长 | 第54-61页 |
| ·HP的过量表达抑制MCF-7细胞的生长 | 第54页 |
| ·HP-MCF-7细胞的条件培养基调节细胞的生长 | 第54-60页 |
| ·Smad4与HP调节细胞生长的关系 | 第60-61页 |
| ·HP过量表达细胞周期停滞在G2/M期 | 第61-62页 |
| ·HP蛋白表达影响癌细胞克隆形成 | 第62-63页 |
| ·TβRⅡ抑制剂对HP调节蛋白表达活性的影响 | 第63-65页 |
| ·TβRⅡ抑制剂对细胞周期蛋白的表达的影响 | 第63-64页 |
| ·TβRⅡ抑制剂对Smads蛋白及下游基因的表达的影响 | 第64-65页 |
| 4.讨论 | 第65-70页 |
| 5.结论及展望 | 第70-71页 |
| ·主要结论 | 第70页 |
| ·后续研究展望 | 第70-71页 |
| 参考文献 | 第71-76页 |
| 致谢 | 第76-77页 |
| 附录 | 第77-84页 |
| 1.克隆 | 第77-78页 |
| 2.引物 | 第78-80页 |
| 3.缓冲液 | 第80-82页 |
| 4.缩写词 | 第82-84页 |
| 攻读硕士学位期间发表或待发表的文章 | 第84页 |
