| 目录 | 第1-8页 |
| 图表目录 | 第8-11页 |
| 中文摘要 | 第11-13页 |
| Abstract | 第13-15页 |
| 英文略语表 | 第15-18页 |
| 序言 | 第18-19页 |
| 第一部分 蛋白质编码序列优化及其在哺乳动物细胞中的高量表达与纯化 | 第19-83页 |
| 前言 | 第20-23页 |
| 1 实验材料 | 第23-28页 |
| ·质粒 | 第23页 |
| ·菌株 | 第23-24页 |
| ·细胞株 | 第24页 |
| ·工具酶、酶切缓冲液及DNA Marker | 第24页 |
| ·主要化学试剂 | 第24页 |
| ·细胞培养用耗材 | 第24页 |
| ·试剂盒 | 第24-25页 |
| ·主要仪器及设备 | 第25页 |
| ·主要溶液配方 | 第25-28页 |
| ·PCR引物 | 第28页 |
| ·主要抗体 | 第28页 |
| 2 实验方法 | 第28-42页 |
| ·序列优化 | 第28-32页 |
| ·单链复性 | 第32页 |
| ·PCR扩增 | 第32-33页 |
| ·酶切消化 | 第33页 |
| ·连接 | 第33-34页 |
| ·转化 | 第34页 |
| ·鉴定 | 第34页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第34-35页 |
| ·质粒DNA的小提 | 第35页 |
| ·质粒DNA的大量提取 | 第35-36页 |
| ·重组质粒DNA浓度的测定 | 第36-37页 |
| ·DNA的线性化及纯化回收 | 第37页 |
| ·贴壁细胞培养 | 第37页 |
| ·稳定表达细胞株的构建 | 第37页 |
| ·细胞冻存 | 第37-38页 |
| ·细胞复苏 | 第38页 |
| ·细胞裂解 | 第38页 |
| ·ELISA检测方法 | 第38-39页 |
| ·Western Blotting检测方法 | 第39-40页 |
| ·蛋白纯化 | 第40-41页 |
| ·用流式细胞术检测表达蛋白的活性 | 第41-42页 |
| 3 实验结果 | 第42-79页 |
| ·优化的编码基因 | 第42-67页 |
| ·将合成片段插入载体,构建表达质粒 | 第67-69页 |
| ·瞬时转染细胞,检测蛋白的表达 | 第69-71页 |
| ·序列优化增加蛋白表达 | 第71页 |
| ·PCR去掉跨膜区以促进蛋白向胞外分泌 | 第71-72页 |
| ·无跨膜区质粒表达检测 | 第72-74页 |
| ·质粒大提 | 第74页 |
| ·构建稳定表达细胞株 | 第74-75页 |
| ·检测融合蛋白的正确表达,并测定表达量 | 第75-77页 |
| ·蛋白纯化 | 第77页 |
| ·融合蛋白H5ΔTM-Fc的活性检测 | 第77-79页 |
| 讨论 | 第79-81页 |
| 小结 | 第81-82页 |
| 参考文献 | 第82-83页 |
| 第二部分 SARS-CoV进入细胞机制的研究 | 第83-121页 |
| 前言 | 第84-87页 |
| 1.实验材料 | 第87-89页 |
| ·质粒 | 第87页 |
| ·菌株 | 第87页 |
| ·细胞株 | 第87页 |
| ·主要试剂与抗体 | 第87-88页 |
| ·主要仪器设备 | 第88页 |
| ·主要溶液配方 | 第88-89页 |
| 2.实验方法 | 第89-96页 |
| ·293E-ACE2-GFP细胞株的构建 | 第89页 |
| ·SARS-CoV刺突蛋白S1190-Fc及对照Fc蛋白的制备 | 第89-90页 |
| ·假病毒包装与感染 | 第90-91页 |
| ·刺突蛋白或假病毒诱导ACE2-GFP蛋白转位 | 第91页 |
| ·免疫荧光 | 第91-93页 |
| ·抑制剂对SARS假病毒进入细胞的影响 | 第93-95页 |
| ·SiRNA实验 | 第95页 |
| ·Transferrin及CTB摄取实验 | 第95-96页 |
| 3 实验结果 | 第96-114页 |
| ·293E-ACE2-GFP细胞株的构建 | 第96-97页 |
| ·S1190-Fc及Fc蛋白的制备 | 第97-98页 |
| ·SARS假病毒的包装 | 第98-100页 |
| ·Spike蛋白诱导ACE2-GFP蛋白向细胞内转位 | 第100-101页 |
| ·Spike蛋白被内吞进入细胞 | 第101-102页 |
| ·受体的循环与阻断 | 第102-103页 |
| ·SARS假病毒诱导ACE2-GFP蛋白向细胞内转位 | 第103-104页 |
| ·受体的循环与阻断 | 第104-105页 |
| ·SARS假病毒绿色荧光蛋白表达时间谱 | 第105-106页 |
| ·SARS假病毒进入Vero E6细胞的过程依赖于pH | 第106-107页 |
| ·SARS假病毒与早期内体Marker EEA1共定位 | 第107页 |
| ·CPZ不能抑制SARS假病毒进入Vero E6细胞 | 第107-108页 |
| ·CHC siRNA不能抑制SARS假病毒进入宿主细胞 | 第108-109页 |
| ·显性负EPS15质粒不能抑制SARS假病毒进入Vero E6细胞 | 第109-111页 |
| ·MβCD,Nystatin及filipin可以有效的抑制Vero E6细胞对CTB的摄取 | 第111-112页 |
| ·MβCD可以有效的抑制SARS假病毒进入Vero E6细胞 | 第112页 |
| ·SARS假病毒进入Vero E6细胞的过程不依赖于caveolin-1 | 第112-113页 |
| ·细胞松弛素D(cytochalasin D)可以抑制SARS假病毒进入细胞 | 第113-114页 |
| 讨论 | 第114-116页 |
| 小结 | 第116-117页 |
| 参考文献 | 第117-121页 |
| 第三部分 H5N1 型禽流感病毒导致急性肺损伤机理的研究 | 第121-164页 |
| 前言 | 第122-124页 |
| 1.实验材料 | 第124-126页 |
| ·质粒 | 第124页 |
| ·菌株 | 第124页 |
| ·细胞株 | 第124页 |
| ·实验动物 | 第124页 |
| ·病毒株 | 第124页 |
| ·主要生化试剂和抗体 | 第124-125页 |
| ·细胞培养试剂 | 第125页 |
| ·SiRNA | 第125页 |
| ·主要仪器及设备 | 第125页 |
| ·主要溶液配制 | 第125-126页 |
| 2.实验方法 | 第126-136页 |
| ·H5N1型禽流感病毒的表面膜蛋白H5蛋白的制备 | 第126-127页 |
| ·人外周血单核细胞的分离 | 第127-128页 |
| ·用流式细胞仪检测H5蛋白或灭活H5N1病毒诱导人外周血单核细胞产生ROS | 第128页 |
| ·用共聚焦显微镜检测H5蛋白或灭活H5N1病毒诱导人外周血单核细胞TLR4受体向细胞表面聚集 | 第128-129页 |
| ·用流式细胞仪检测H5蛋白或灭活H5N1病毒诱导人外周血单核细胞TLR4受体向细胞表面聚集 | 第129页 |
| ·电镜观察灭活的H5N1型禽流感病毒诱导小鼠肺组织产生autophagy | 第129-130页 |
| ·电镜观察H5N1型禽流感病毒诱导细胞产生autophagy | 第130-131页 |
| ·用共聚焦显微镜观察灭活H5N1型禽流感病毒诱导细胞LC3的凝集变化 | 第131页 |
| ·用Western Blot检测灭活H5N1型禽病毒感染A549细胞后蛋白表达水平的变化 | 第131页 |
| ·细胞活力实验 | 第131-132页 |
| ·细胞水平siRNA实验 | 第132页 |
| ·灭活H5N1型禽流感病毒诱导小鼠肺损伤的病理检查 | 第132页 |
| ·灭活H5N1型禽流感病毒诱导小鼠肺弹性的检测 | 第132-133页 |
| ·H5N1型禽流感病毒诱导小鼠肺水肿及3MA的预防作用 | 第133页 |
| ·H5N1型禽流感病毒诱导小鼠肺水肿及3MA的治疗作用 | 第133-134页 |
| ·H5N1型禽流感病毒诱导小鼠死亡率检测及3MA的预防作用 | 第134页 |
| ·H5N1型禽流感病毒诱导小鼠死亡率检测及3MA的治疗作用 | 第134页 |
| ·小鼠肺组织Atg5 siRNA敲除实验 | 第134-136页 |
| 3.实验结果-1:H5N1通过产生ROS诱导急性肺损伤发生 | 第136-146页 |
| ·重组H5蛋白的制备 | 第136-138页 |
| ·H5蛋白诱导人外周血单核细胞产生ROS | 第138-139页 |
| ·灭活的H5N1禽流感病毒诱导人外周血单核细胞产生ROS | 第139-140页 |
| ·Confocal检测H5蛋白引起人外周血单核细胞TLR4向细胞表面聚集 | 第140页 |
| ·Confocal检测灭活的H5N1禽流感病毒引起人外周血单核细胞TLR4向细胞表面聚集 | 第140-141页 |
| ·流式细胞术检测H5蛋白引起人外周血单核细胞TLR4向细胞表面聚集 | 第141-142页 |
| ·流式细胞术检测灭活的H5N1禽流感病毒引起人外周血单核细胞TLR4向细胞表面聚集 | 第142-143页 |
| ·灭活H5N1处理的小鼠肺组织中有氧化磷脂(OxPLs)产生 | 第143页 |
| ·TLR4基因敲除小鼠及TRIF基因敲除小鼠肺损伤程度明显改善 | 第143-144页 |
| ·H5N1诱导的肺损伤与IL-6的产生相关 | 第144页 |
| ·H5N1通过ROS激活TLR4-TRIF-NFkB通路诱发急性肺损伤 | 第144-146页 |
| 4.实验结果-2:H5N1通过诱导细胞发生自噬导致急性肺损伤 | 第146-159页 |
| ·H5N1诱导小鼠肺泡上皮细胞发生自噬 | 第146页 |
| ·H5N1病毒诱导A549细胞发生自噬 | 第146-147页 |
| ·H5N1诱导LC3凝集 | 第147-148页 |
| ·H5N1诱导LC3 Ⅱ表达上调 | 第148-149页 |
| ·H5N1通过诱导自噬导致A549细胞死亡 | 第149页 |
| ·Atg12 siRNA可以缓解H5N1导致的细胞死亡 | 第149-150页 |
| ·H5N1引起mTOR磷酸化水平下调 | 第150页 |
| ·TSC2敲除后细胞发生自噬减少 | 第150-151页 |
| ·TSC2敲除后细胞生存力升高 | 第151-152页 |
| ·H5N1引起Akt磷酸化水平下调 | 第152页 |
| ·H5N1病毒导致细胞自噬通路图 | 第152-153页 |
| ·H5N1病毒处理小鼠引起小鼠肺损伤的病理结果 | 第153页 |
| ·3MA可以抑制H5N1诱导的LC3 Ⅱ的升高 | 第153-154页 |
| ·3MA可以改善灭活H5N1病毒处理小鼠的肺弹性 | 第154页 |
| ·3MA作为预防性药物可以减缓H5N1导致的肺水肿程度 | 第154-155页 |
| ·3MA作为预防性药物可以降低H5N1导致的小鼠死亡率 | 第155页 |
| ·3MA作为治疗性药物可以减缓H5N1导致的肺水肿程度 | 第155-156页 |
| ·3MA作为治疗性药物可以降低H5N1导致的小鼠死亡率 | 第156页 |
| ·Atg5 siRNA可以改善灭活H5N1病毒处理小鼠的肺弹性 | 第156-157页 |
| ·Atg5 siRNA可以减缓H5N1导致的肺水肿程度 | 第157页 |
| ·Atg5 siRNA可以降低H5N1导致的小鼠死亡率 | 第157-159页 |
| 讨论 | 第159-161页 |
| 小结 | 第161-162页 |
| 参考文献 | 第162-164页 |
| 第四部分 H5N1型禽流感病毒进入A549细胞机制的研究 | 第164-180页 |
| 前言 | 第165-166页 |
| 1.实验材料 | 第166-168页 |
| ·细胞株 | 第166页 |
| ·病毒株 | 第166页 |
| ·主要试剂与抗体 | 第166页 |
| ·主要仪器设备 | 第166-167页 |
| ·SiRNA | 第167页 |
| ·主要溶液配方 | 第167-168页 |
| 2 实验方法 | 第168-170页 |
| ·MTT实验 | 第168页 |
| ·抑制剂对细胞活力的影响 | 第168页 |
| ·SiRNA实验 | 第168-169页 |
| ·CTB摄取实验 | 第169-170页 |
| 3 实验结果 | 第170-177页 |
| ·灭活H5N1病毒造成的A549细胞死亡具有剂量依赖效应 | 第170页 |
| ·灭活H5N1病毒造成的A549细胞死亡具有时间依赖特性 | 第170-171页 |
| ·氯喹可以缓解H5N1造成的细胞死亡 | 第171页 |
| ·Bafilomycin A1可以缓解H5N1造成的细胞死亡 | 第171-172页 |
| ·CPZ可以缓解H5N1造成的细胞死亡 | 第172页 |
| ·CHC siRNA可以缓解H5N1造成的细胞死亡 | 第172-173页 |
| ·Clathrin siRNA可以有效的将clathrin HC敲除 | 第173-174页 |
| ·MβCD,Nystatin和filipin可以有效的抑制细胞对CTB的摄取 | 第174页 |
| ·MβCD不能缓解H5N1造成的细胞死亡 | 第174-175页 |
| ·Nystatin不能缓解H5N1造成的细胞死亡 | 第175页 |
| ·Filipin不能缓解H5N1造成的细胞死亡 | 第175-177页 |
| 讨论 | 第177-178页 |
| 小结 | 第178-179页 |
| 参考文献 | 第179-180页 |
| 综述1-Molecular pathogenesis of severe acute respiratory syndrome | 第180-196页 |
| 综述2-Avian Influenza H5N1:An Update on Molecular Pathogenesis | 第196-205页 |
| 致谢 | 第205-206页 |
| 个人简历 | 第206-208页 |
