| 中文摘要 | 第11-13页 |
| 英文摘要 | 第13-15页 |
| 1 引言 | 第16-35页 |
| 1.1 大肠杆菌的结构及理化特性 | 第16-17页 |
| 1.2 致病性大肠杆菌的分类 | 第17-19页 |
| 1.2.1 产肠毒素大肠杆菌 | 第18页 |
| 1.2.2 肠致病性大肠杆菌 | 第18页 |
| 1.2.3 肠侵袭性大肠杆菌 | 第18-19页 |
| 1.2.4 肠出血性大肠杆菌 | 第19页 |
| 1.2.5 肠聚集性大肠杆菌 | 第19页 |
| 1.2.6 尿道致病性大肠杆菌 | 第19页 |
| 1.3 ETEC与仔猪腹泻 | 第19-27页 |
| 1.3.1 黏附素 | 第20-23页 |
| 1.3.2 肠毒素 | 第23-27页 |
| 1.4 大肠杆菌疫苗研究进展 | 第27-32页 |
| 1.4.1 大肠杆菌传统疫苗 | 第27-28页 |
| 1.4.2 大肠杆菌基因工程疫苗 | 第28-32页 |
| 1.5 同源重组技术 | 第32-34页 |
| 1.6 研究目的与意义 | 第34-35页 |
| 2 材料与方法 | 第35-56页 |
| 2.1 实验材料 | 第35-40页 |
| 2.1.1 菌株、载体、实验动物、细胞系及ELISA包被抗原 | 第35页 |
| 2.1.2 抗体、酶、培养基及其他试剂材料 | 第35-36页 |
| 2.1.3 PCR引物 | 第36-40页 |
| 2.1.4 主要仪器 | 第40页 |
| 2.2 实验方法 | 第40-56页 |
| 2.2.1 Mab D5中和活性验证 | 第40-41页 |
| 2.2.2 LT1B的中和表位分析 | 第41-42页 |
| 2.2.3 假基因鉴定 | 第42页 |
| 2.2.4 双向筛选平台的构建 | 第42-46页 |
| 2.2.5 重组菌株E.coli ER-T和E.coli ER-X的构建 | 第46-48页 |
| 2.2.6 重组菌作为口服疫苗的可行性分析 | 第48-51页 |
| 2.2.7 E.coli ER-T和E.coli ER-X对小鼠的免疫学指标测定 | 第51-53页 |
| 2.2.8 E.coli ER-T和E.coli ER-X对猪的免疫学指标测定 | 第53-55页 |
| 2.2.9 统计学分析 | 第55-56页 |
| 3 结果 | 第56-130页 |
| 3.1 MABD5中和活性验证 | 第56-60页 |
| 3.1.1 MAbD5阻断LT1与GM1受体结合 | 第56页 |
| 3.1.2 体外中和试验 | 第56-57页 |
| 3.1.3 小鼠体内的中和试验 | 第57页 |
| 3.1.4 兔肠袢结扎试验 | 第57-58页 |
| 3.1.5 仔猪体内的中和试验 | 第58-59页 |
| 3.1.6 单抗治疗试验 | 第59-60页 |
| 3.2 LT1B亚单位B细胞抗原表位预测与分析 | 第60-61页 |
| 3.2.1 LT1B蛋白序列分析及其B细胞抗原表位预测 | 第60-61页 |
| 3.2.2 预测表位和鉴定表位在LT1B 3D结构上的定位分析 | 第61页 |
| 3.3 E.COLI O142: △STA中可能存在的假基因位置鉴定 | 第61-62页 |
| 3.4 基于∧噬菌体KIL基因双向筛选平台的构建 | 第62-65页 |
| 3.4.1 假基因左、右同源臂的扩增 | 第62-63页 |
| 3.4.2 重组打靶载的鉴定 | 第63-64页 |
| 3.4.3 双向筛选平台的PCR鉴定 | 第64-65页 |
| 3.4.4 双向筛选平台的反向筛选验证 | 第65页 |
| 3.5 重组菌株E.COLI ER-T和E.COLI ER-X的构建及鉴定 | 第65-68页 |
| 3.5.1 嵌合类毒素基因的构建及鉴定 | 第65-66页 |
| 3.5.2 打靶载体的鉴定 | 第66-67页 |
| 3.5.3 重组菌的验证 | 第67页 |
| 3.5.4 重组菌的PCR鉴定及测序 | 第67-68页 |
| 3.5.5 重组菌的Western blot分析 | 第68页 |
| 3.6 重组菌作为口服疫苗的可行性评价 | 第68-75页 |
| 3.6.1 细胞毒性实验 | 第69页 |
| 3.6.2 E.coli ER-T及E.coli ER-X对乳鼠的毒性 | 第69-70页 |
| 3.6.3 E.coli ER-T及E.coli ER-X对胃液环境的耐受性 | 第70页 |
| 3.6.4 E.coli ER-T及E.coli ER-X对肠液环境耐受性 | 第70-71页 |
| 3.6.5 E.coli ER-T和E.coli ER-X对胆汁的耐受性 | 第71页 |
| 3.6.6 E.coli ER-T和E.coli ER-X的口服安全性 | 第71-72页 |
| 3.6.7 E.coli ER-T和E.coli ER-X的生长曲线 | 第72-73页 |
| 3.6.8 E.coli ER-T和E.coli ER-X的电镜观察 | 第73-74页 |
| 3.6.9 E.coli ER-T和E.coli ER-X的遗传稳定性 | 第74页 |
| 3.6.10 E.coli ER-T及ER-X的定植能力 | 第74-75页 |
| 3.7 E.COLI ER-T及E.COLI ER-X对小鼠的口服免疫效果测定 | 第75-106页 |
| 3.7.1 免疫小鼠特异性抗体IgG测定 | 第75-81页 |
| 3.7.2 免疫小鼠特异性抗体sIgA测定 | 第81-89页 |
| 3.7.3 淋巴细胞增殖试验 | 第89-91页 |
| 3.7.4 细胞因子IFN-γ和IL-4的检测 | 第91-92页 |
| 3.7.5 体外中和试验 | 第92-98页 |
| 3.7.6 乳鼠体内中和试验 | 第98-104页 |
| 3.7.7 乳鼠攻毒保护试验 | 第104-106页 |
| 3.8 重组菌株对猪的口服免疫效果测定 | 第106-130页 |
| 3.8.1 E.coli ER-T及E.coli ER-X在猪肠道内的定植能力 | 第106-107页 |
| 3.8.2 免疫猪特异性IgG抗体测定 | 第107-111页 |
| 3.8.3 免疫猪特异性sIgA抗体测定 | 第111-116页 |
| 3.8.4 猪淋巴细胞增殖试验 | 第116-117页 |
| 3.8.5 细胞因子检测 | 第117页 |
| 3.8.6 体外中和试验 | 第117-123页 |
| 3.8.7 乳鼠体内中和试验 | 第123-127页 |
| 3.8.8 攻毒保护试验 | 第127-130页 |
| 4 讨论 | 第130-137页 |
| 4.1 肠毒素作为疫苗抗原的必要性 | 第130页 |
| 4.2 口服疫苗对预防仔猪大肠杆菌性腹泻的前景 | 第130-131页 |
| 4.3 载体菌株的选择 | 第131-132页 |
| 4.4 重组基因的启动子选择 | 第132页 |
| 4.5 假基因内插入重组基因遇到的问题及思考 | 第132-134页 |
| 4.6 LT1B受体结合位点的筛选 | 第134页 |
| 4.7 重组基因的构建策略 | 第134-135页 |
| 4.8 重组菌的免疫效果分析 | 第135-137页 |
| 5 结论 | 第137-138页 |
| 致谢 | 第138-139页 |
| 参考文献 | 第139-151页 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 | 第151页 |
